ISO 18184:2019
(Main)Textiles — Determination of antiviral activity of textile products
Textiles — Determination of antiviral activity of textile products
This document specifies testing methods for the determination of the antiviral activity of the textile products against specified viruses. Due to the individual sensitivities, the results of one test virus cannot be transposed to other viruses. The textile products include woven and knitted fabrics, fibres, yarns, braids, etc.
Textiles — Détermination de l'activité virucide de produits textiles
Le présent document spécifie des méthodes d'essai permettant d'évaluer l'activité virucide des produits textiles contre des virus spécifiés. En raison des différences de sensibilité, les résultats obtenus avec un virus d'essai ne peuvent pas être transposés à d'autres virus. Les produits textiles incluent les tissus, les tricots, les fibres, les fils, les tresses, etc.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 18184
Second edition
2019-06
Textiles — Determination of antiviral
activity of textile products
Textiles — Détermination de l'activité virucide de produits textiles
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Virus and host cell . 3
6 Warning . 3
7 Apparatus . 3
8 Sterilization of apparatus . 6
9 Reagent and medium . 6
10 Preparation .11
10.1 Restoration of host cell from cryopreservation .11
10.2 Subculture of host cell .12
10.3 Cell culture for the infectious virus titre assay .13
10.4 Preparation for test virus .13
10.4.1 General.13
10.4.2 Influenza virus .13
10.4.3 Feline calicivirus.14
10.4.4 Infectivity titre of the test viruses .15
10.5 Preparation for test specimen .16
10.5.1 Control fabric .16
10.5.2 Preparation of test specimens .16
10.5.3 Sterilization of specimens .16
10.6 Control test .16
10.6.1 General.16
10.6.2 Verification of cytotoxicity by cell sensitivity to virus and the inactivation
of antiviral activity .17
11 Test procedure .17
11.1 Preparation of specimen.17
11.2 Deposit of virus to the specimens .17
11.3 Contacting time.17
11.4 Wash-out of virus immediately after deposit .18
11.5 Wash-out of virus after contacting time.18
12 Preparation of the series of the dilution for the virus suspension .18
13 Determination of the infectious titre .18
13.1 Plaque assay .18
13.2 TCID method .19
14 Calculation of infectivity titre .19
14.1 Plaque assay .19
14.2 TCID method .19
14.2.1 Behrens and Karber method .19
14.2.2 Example of calculation .20
14.3 Test result .22
14.3.1 Verification of this test .22
14.3.2 Calculation of antiviral activity value .22
15 Test report .22
Annex A (informative) Virus strains and host cells .23
Annex B (normative) Infectivity titre test: Plaque assay .24
Annex C (normative) Infectivity titre test: TCID method .26
Annex D (informative) Composition of media .27
Annex E (informative) Testing method using specific pathogen free (SPF) embryonated
hen's eggs .30
Annex F (informative) Antiviral efficacy — Antiviral performance of the products.35
Annex G (informative) Interlaboratory test result (1) .36
Annex H (informative) Interlaboratory test result (2) .38
Bibliography .41
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textile.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 18184:2014), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows:
— Clause 1 has been updated;
— in Clause 5, viruses and host cells used in this document has been changed to examples of species;
— in 10.6, "Verification of cytotoxic effect” has been removed;
— 11.1, “Preparation of specimen” has been updated;
— 14.3.2, “Calculation of antiviral activity value” has been updated;
— Annex E (Additional virus: Polio virus) has been removed.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
Introduction
Recently, along with the global improvement in the level of living, consumers are showing the trend to
seek healthcare or health protective products. Also, an increase in the people’s interest for protection
against epidemic diseases has been noted, as the overcrowded commuting train car where the
commuters experience every day, the hospitals, nursing homes, etc.
Being supported by the processing technology of textile products to provide a high performance which
has been highly developed recently, the health protective and hygiene relating products have been
advancing into the market.
Because those products are relatively new and included the technical aspects out of textile technology,
the testing methods have been developed by the individual producers to evaluate the product
performance. That has resulted in inexistence of a unified test method, hindering for both consumers
and producers a true explanation or understanding of those high functional products.
The antiviral product is one of those products and includes the technical fields of the textile technology
and the biotechnology.
The demand to establish an international standard has been growing in the consumers, retailers,
producers, etc. as the stakeholders in the market.
Antiviral textile products are textiles capable of reducing the number of infective virus particles that
contact the surface of the textile. This document provides a quantitative test method to assess the
antiviral performance of such products.
The data obtained in an objective manner by this document give the common knowledge to all the
stake holders such as consumers, producers, retailers, etc. to understand the correct performance of
the antiviral textile products.
There are two methods to quantify the number of infective virus, as infective virus titre in this
document, which are the plaque method and the TCID method. The method used can be selected by
the experience and the convenience of each testing house. Any appropriate cellular system can be used
and that the testing conditions when used should be reported.
See Annexes G and H for interlaboratory test results.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 18184:2019(E)
Textiles — Determination of antiviral activity of textile
products
1 Scope
This document specifies testing methods for the determination of the antiviral activity of the textile
products against specified viruses. Due to the individual sensitivities, the results of one test virus
cannot be transposed to other viruses.
The textile products include woven and knitted fabrics, fibres, yarns, braids, etc.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 105-F02, Textiles — Tests for colour fastness — Part F02: Specification for cotton and viscose
adjacent fabrics
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
virus
original biological entity which has a single type of nucleic acid (DNA or RNA), specific structure
that opposes the virus to living organisms with a cellular structure (prokaryotes and eukaryotes),
and reproduces from its genetic material by replication within the host cell, and leads to absolute
intracellular parasitism
Note 1 to entry: The virion is the infectious viral particle.
3.2
virus activity
ability to replicate in the susceptible and permissive host cells
3.3
antiviral activity
property of any substance (chemical or otherwise) producing a modification of one of the elements of
the virion structure which induces the latter's inability to replicate
Note 1 to entry: Property that reduces the viral activity, generally through morphological change or structural
damage to the surface protein of the virus.
Note 2 to entry: It is not necessarily to imply that the change of antigenic response or the change of constituent
element is the reduction of virus infectivity.
3.4
antiviral chemicals
inorganic or organic chemicals able to reduce virus activity (3.2)
Note 1 to entry: The organic antiviral chemicals give the change to the surface protein of virus by the chemical
adsorption. The inorganic metallic antiviral substances destroy or change the morphology of the virus by the
extraction of hydrogen atom in the virus protein by OH radicals which are generated by the radical reaction.
3.5
control fabric
fabric used to verify the stability of the test virus on a textile fabric
Note 1 to entry: The fabrics before the antivirus treatment should be used as a control fabric with the same
condition described in 3.5.
Note 2 to entry: In the absence of a control fabric as described in Note 1, the 100 % cotton cloth described in
ISO 105-F02 should be used without any chemical treatments such as the fluorescent bleach, etc.
3.6
control test
test to confirm that a specimen does not affect the host cell
Note 1 to entry: This test is performed as same as actual test, but without virus.
Note 2 to entry: Also referred to as control test of specimen,
3.7
cytopathic effect
cytopathic effect (CPE) caused by virus
effect appears as morphological change or destruction of the host cells as a result of the virus
multiplication
3.8
infectivity titre of virus
number of infectious viral particles present per unit volume in a cell lysate or in viral suspension
3.9
plaque
area of lysed cells in a monolayer cell culture
3.10
plaque forming units
PFU
unit expressed as the concentration of the infectious virus per unit volume
3.11
plaque assay
assay to determine the infectivity titre of virus (3.8) from PFU by using the series of dilution
3.12
TCID
50 % infectious dose of a wash-out virus suspension or the dilution of the virus suspension that induces
a CPE in 50 % of cell culture units
Note 1 to entry: See 3.7.
3.13
TCID method
assay to determine the infectivity titre of virus (3.8) from TCID50 by using the series of dilution
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3.14
cytotoxicity
morphological alteration of cells and/or their destruction or the reduction of their sensitivity to the
multiplication of viruses induced by a product
4 Principle
The viruses are deposited onto a specimen. After specific contact time, the remaining infectious virus
is counted, and the reduction rate is calculated by the comparison between the antiviral product test
specimen and the control specimen by common logarithm. There are two methods to quantify the
infectious virus titre. One method is the plaque assay and the other is the TCID method. The selection
of the method depends on the convenience and experience of the testing organization.
5 Virus and host cell
Examples of species of viruses and host cells are shown in Annex A.
Other species of viruses and host cells can be used after appropriate validations, as the important virus
may differ depending on target application. If the other species are used, the name of the species and
the specific reason for their use shall be included in the test report.
NOTE Reference viruses are listed in EN 14476 and EN 14675.
6 Warning
This document calls for use of the infectious viruses or substances/procedures that may be injurious
to the health/environment if appropriate conditions are not observed. It refers only to technical
suitability and does not absolve the user from legal obligations relating to health and safety/
environment at any stage.
The warning is extended as the following. The virus in the standard shall be the one of biotechnology
safety level class II classified by the directives of WHO as stated. The user of this document shall have
enough knowledge and experience of the microbiology. Moreover, users shall comply strictly to the
safety standard of the manufacturers and the domestic regulation.
7 Apparatus
7.1 High pressure steam sterilizer: Autoclave, capable of operating at a temperature of (121 ± 2) °C.
NOTE The autoclave is described in EN 12353.
7.2 Dry heat sterilizer: Ovens, capable of operating at a temperature of (180 ± 2) °C and (160 ± 2) °C.
NOTE The hot air ovens are described in EN 12353.
7.3 Measuring flask, with capacity of 1 l.
7.4 Scale, with the available range of 0,01 g to 100 g with accuracy of 1,0 %.
7.5 Pipette, of various capacities with accuracy of 10 % of the nominal volume.
7.6 Washing machine.
7.7 Pipetter, capable of mounting the glass or plastic pipettes.
7.8 Micropipette, having the most suitable volume for each use, with a tip made of glass or plastic,
and with a tolerance of 0,5 % or less.
7.9 Water bath, capable of maintaining at a temperature of (37 ± 1) °C, (50 ± 1) °C and (56 ± 1) °C.
1)
7.10 Vortex® -type mixer, used for microbial testing.
7.11 Freezer, capable of operating at a temperature of (–80 ± 2) °C or (–20 ± 2) °C.
7.12 Liquid nitrogen bath, for the preservation approximately at −196 °C.
7.13 Membrane filtration device, with a pore size of 0,22 μm.
7.14 Refrigerator, capable of operating at a temperature between 2 °C and 8 °C.
7.15 pH meter, having an inaccuracy of calibration ±0,1 pH units at (20 ± 1) °C.
NOTE The pH meters are described in EN 12353.
7.16 Inverted microscope, capable of being used for cultured cells observation.
7.17 Tweezers, capable of being sterilized.
7.18 Centrifuge, capable of being operated at a temperature of (4 ± 2) °C, and relative centrifugal force
of approximately 1 000 g.
7.19 Biological safety cabinet, class II.
7.20 Vial container, with a capacity of 30 ml and closed with the screw cap. The gasket is made of
perfluoroethylene or silicone and the cap is made of polypropylene.
7.21 96 wells microplate with the gamma radiation sterilization, for TCID method.
96 wells microplates with other sterilization finish may be used after appropriate validation for the
growth of cells. See Figure 1.
1) This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
of ISO by this product.
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Figure 1 — 96 wells microplate for TCID method
7.22 6 wells plastic plate with the gamma radiation sterilization, for plaque assay.
6 wells plates with other sterilization finish may be used after appropriate validation for the growth of
cells. See Figure 2.
Figure 2 — 6 wells plastic plate for plaque assay
7.23 Flask, for cell culture use with the gamma radiation sterilization finish, with an adherent type,
a cell culture area of 75 cm and with the vent cap. The vent cap can exchange abacterial air through
0,2 μm filter. See Figure 3.
Flask with other sterilization finish may be used after appropriate validation for the growth of cells.
Figure 3 — Flask for cell culture use
7.24 CO incubator, capable of maintaining an atmosphere with 5 % CO , at a temperature of (34 ± 1) °C
2 2
and (37 ± 1) °C.
NOTE Certain CO incubators are described in EN 12353.
7.25 Incubator, capable of maintaining at a temperature of (25 ± 1) °C, (35 ± 1) °C and (37 ± 1) °C.
NOTE Certain incubators are described in EN 12353.
7.26 Centrifuge tube.
7.27 Culture container.
7.28 Test tube.
7.29 Beaker.
8 Sterilization of apparatus
Sterilize all apparatus which come in contact with the cells, the chemicals, or test specimen. The
sterilization method shall be used by high pressure steam or dry heat method.
— High pressure steam sterilization: by an autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a pressure of
103 kPa for 15 min.
— Dry-heat sterilization: by a dry heat sterilizer (7.2) at a temperature of 180 °C for 30 min or 160 °C
for 2 h.
In case of plastics products, heat-resistant plastics products or sterilization finish plastics products
may be used.
9 Reagent and medium
All reagents shall have the quality suitable for virological needs, i.e. free of toxic substances for testing
microorganisms. Some of the media are available in the market.
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9.1 Water, which shall be analytical-grade water for microbiological media preparation, which is ion-
exchanged and/or freshly distilled and/or ultra-filtered and/or filtered with RO (reverse osmosis).
9.2 Eagle's minimum essential medium (EMEM), Roswell Park Memorial Institute medium
(RPMI), available in the market. The composition is described in Annex D. If there are any components
missing from the composition, add them according to the composition table.
9.3 7,5 % sodium bicarbonate solution.
9.3.1 Sterilize sodium bicarbonate, 75 g in autoclave in a culture container with a cap closed tightly.
9.3.2 Water is also sterilized by autoclave.
9.3.3 Dissolve sodium bicarbonate in the sterilized water of 1 000 ml well.
Alternative preparation (replacing 9.3.1, 9.3.2, and 9.3.3) as follows. Prepare 7,5 % sodium bicarbonate
solution by dissolving 75 g of sodium bicarbonate in 1 000 ml of water. Sterilize the solution by using
0,22 μm membrane filter.
9.4 Formaldehyde solution.
Prepare a formaldehyde solution at the concentration of 3,7 % in water.
The other solution for cell fixation may be used after appropriate validation for the cell fixation.
9.5 Methylene blue solution.
9.5.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Water, 1 000 ml;
— Methylene blue, 0,375 g;
— 1 mol/l sodium hydroxide solutions 62,5 μl.
9.5.2 Dissolve and mix well.
9.6 Inactivated fetal bovine serum (FBS)
9.6.1 Put the freezed cryopreserved fetal bovine serum in a package in the water bath (7.9) at a
temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
9.6.2 Then, raise the temperature of the water bath to 56 °C and keep it for 30 min to inactivate.
9.6.3 Divide it into several tubes. Put them in the freezer (7.11) at a temperature lower than –20 °C
until usage for testing.
9.6.4 Just before use, put it in the water bath at a temperature of 37 °C and keep it until defrosting.
9.7 Growth medium.
9.7.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, and put the following materials into the flask:
— Water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 60 mg;
— Eagle's minimum essential medium (EMEM) (D.2), 9,53 g, or RPMI 1640 medium (D.3), 10,4 g.
9.7.2 Dissolve and mix well and make up whole solution to 1 000 ml by water.
9.7.3 Sterilize the mixed solution from 9.7.2 by using 0,22 μm filter (7.13).
9.7.4 Add 15 ml of 7,5 % sodium bicarbonate solution (9.3) and 100 ml of the inactivated fetal bovine
serum (9.6) in the solution from 9.7.3.
9.8 Maintenance medium.
9.8.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 60 mg;
— Eagle's minimum essential medium, 9,53 g.
9.8.2 Dissolve them well, then, make up the whole amount to 1 000 ml by adding water.
9.8.3 Sterilize the mixed solution from 9.8.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.8.4 Add 15 ml of 7,5 % sodium bicarbonate solution (9.3) in the solution from 9.8.3.
9.9 Double concentration of the maintenance medium (9.8).
9.9.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Water, 800 ml;
— Kanamycin sulfate, 120 mg;
— Eagle's minimum essential medium, 19,06 g.
9.9.2 Dissolve them well, then, make up the whole amount to 1 000 ml by adding water.
9.9.3 Sterilize the mixed solution from 9.9.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.10 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-).
9.10.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the flask:
— Sodium chloride, 8 g;
— Potassium chloride, 0,2 g;
— Disodium hydrogen phosphate 12 H O, 2,9 g;
— Potassium dihydrogen phosphate, 0,2 g.
9.10.2 Add water by making up whole amount to 1 000 ml and dissolve well.
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9.10.3 Then, transfer the solution (9.10.2) to a culture container, then sterilize the solution from 9.10.2
by using an autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C for 15 min.
9.11 Trypsin derived from beef pancreas and PBS (-) solution.
9.11.1 Prepare a beaker, then, put the following materials in the beaker:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 100 ml;
— Trypsin derived from beef pancreas, 1,0 g.
9.11.2 Dissolve and mix well by using mixer for 2 h.
9.11.3 Then, sterilize the solution 9.11.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
The divided solution tubes that are not used immediately are preserved in the freezer at a temperature
of lower than −80 °C until usage for testing.
9.11.4 Prepare a test tube and put the following solutions in the test tube:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 9 ml;
— Trypsin derived from beef pancreas and PBS (-) mixed solution (9.11.3), 1 ml.
9.11.5 Dissolve and mix them well.
9.11.6 Divide the solution in test tubes and preserve in the freezer at a temperature of lower than −20 °C
until usage for testing.
9.11.7 Just before using, put it in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it until
defrosting.
9.12 Trypsin EDTA solution.
9.12.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10), 1 000 ml;
— Trypsin, 2,5 g;
— Kanamycin sulfate, 0,1 g;
— Streptomycin sulfate, 0,1 g;
— Amphotericin B, 2 mg;
— Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0,014 mol.
9.12.2 Dissolve and mix well.
9.12.3 Then, sterilize the solution from 9.12.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.12.4 Divide the solution in test tubes and preserve in the freezer at a temperature lower than −20 °C
until usage for testing.
9.12.5 Before usage, place the test tube in a water bath (7.9) at 37 °C until fully defrosted.
Trypsin EDTA solution is available in the market. The products with the different components from
9.12.1, may be used after proper validation.
9.13 DEAE-dextran solution.
9.13.1 Prepare a measuring flask (7.3) of 1 l, then, put the following materials in the measuring flask:
— Water, 1 000 ml;
— Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, 20 g.
9.13.2 Dissolve and mix well.
9.13.3 Sterilize the solution from 9.13.2 by using the filter (7.13) with a pore size of 0,22 μm.
9.14 Agar medium preparation.
This is prepared with liquid A (9.14.1) and liquid B (9.14.2) and mixed just before using (9.14.3).
9.14.1 Liquid A.
9.14.1.1 Prepare a sterilized culture container (7.27) of 1 l, then, put the following materials in the
culture container:
— Double concentration of maintenance medium (9.9), 1 000 ml;
— DEAE-dextran solution (9.13), 10 ml;
— 7,5 % sodium bicarbonate solution (9.3), 40 ml.
Mix well.
9.14.1.2 Only for the influenza virus test and for the plaque assay, add 3,0 ml of the Trypsin from beef
pancreas and PBS (-) solution (9.11).
9.14.1.3 Put the solution from 9.14.1.1 or 9.14.1.2 in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and
keep it until using.
9.14.2 Liquid B.
9.14.2.1 Prepare a culture container (7.27) of 2 l, then, put the following materials in the culture
container:
— Water, 1 000 ml;
— Cell culture agar, 15 g.
Mix well.
9.14.2.2 Sterilize mixed solution from 9.14.2.1 by using autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a
pressure of 103 kPa for 15 min.
9.14.2.3 Put the solution from 9.14.2.2 in the water bath (7.9) at a temperature of 50 °C and keep it
until using.
10 © ISO 2019 – All rights reserved
9.14.3 Mix liquid A and liquid B at 1:1 (vol/vol).
9.15 SCDLP medium, used for washing-out and for suppression of agent activity of the treated textile
product.
9.15.1 Prepare a culture container (7.27) of 1 l, then, put the following materials in the culture container:
— Water, 1 000 ml;
— Peptone made of casein, 17,0 g;
— Peptone made of soybean, 3,0 g;
— Sodium chloride, 5,0 g;
— Dipotassium hydrogen phosphate, 2,5 g;
— D-Glucose, 2,5 g;
— Lecithin, 1,0 g.
Mix together and dissolve well, then, add:
— Nonionic surfactant (Tween 80), 7,0 g.
Dissolve and mix well.
9.15.2 Adjust the solution from 9.15.1 to pH 7,0 ± 0,2 by the sodium hydroxide solution or the
hydrochloric acid solution in the water bath (7.9) at a temperature of 25 °C.
9.15.3 Sterilize the mixed solution from 9.15.2 by using autoclave (7.1) at a temperature of 121 °C and a
pressure of 103 kPa for 15 min.
9.16 Maintenance medium with Trypsin.
9.16.1 Prepare a sterilized culture container (7.27) of 1 l, then, put the following materials in the culture
container:
— Maintenance medium (9.8), 1 000 ml;
— Trypsin from beef pancreas and PBS(-) solution (9.11), 3,0 ml.
Dissolve them well.
10 Preparation
10.1 Restoration of host cell from cryopreservation
10.1.1 Put the cryopreserved host cell in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it for
rapid defrosting.
10.1.2 Prepare a new flask for cell culture (7.23) with a vent cap lid and add 20 ml of growth medium
(9.7) in the flask.
10.1.3 Put whole ampule of defrosted host cell (see 10.1.1) in the flask.
10.1.4 Put the flask in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and keep it for (24 ± 2) h to
culture the host cell.
10.1.5 Then, observe the flask (see 10.1.4) by microscope if the cells are attached on the bottom of
the flask.
If the growth is confirmed, then, go to next step. If not, continue to keep in the incubator.
10.1.6 Drain the remained growth medium in the flask of 10.1.5.
10.1.7 Add 20 ml of the new growth medium (9.7) to the flask of 10.1.6.
10.1.8 Put the flask of 10.1.7 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C for (48 ± 2) h.
10.1.9 Observe the flask of 10.1.8 using a microscope and confirm if the cells are cultured as a confluent
growth on the bottom of the flask. If the growth of cells is not enough, continue with the step specified in
10.1.8 until the sufficient growth is confirmed.
10.1.10 Then, proceed to the serial subcultivation by taking the following steps of 10.2.
10.2 Subculture of host cell
10.2.1 Drain an extra growth medium of the flask when 10.1.8 is completed.
10.2.2 Add 5 ml of 0,01 mol/l phosphate buffered saline PBS (-) (9.10) and wash the surface of the
grown cells on the bottom of the flask by the solution, then drain the extra PBS (-).
Repeat 3 times of this washing procedure.
10.2.3 Add 0,5 ml of Trypsin EDTA solution (9.12) in the flask of 10.2.2 and spread the solution over the
whole surface.
10.2.4 Put the flask of 10.2.3 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C for 10 min ± 1 min to
keep warm.
10.2.5 Observe visually the flask of 10.2.4 if the grown cells are starting to come off, if confirmed, tap the
side of the flask and disperse the cells.
10.2.6 Add 5 ml of the growth medium (9.7) in the flask of 10.2.5 and pipetting the medium to make it
mild. Mix well to avoid the damage to the cells.
10.2.7 Prepare a new flask for cell culture (7.23) and add 20 ml of the growth medium (9.7).
10.2.8 Add 1 ml of the cell suspension of 10.2.6 by the pipette to 10.2.7.
The amount of the cell suspension of 10.2.6 may be changed as needed.
10.2.9 Close the cap of the flask of 10.2.8 and put the flask in the CO incubator (7.24) at a temperature
of 37 °C for 5 days to culture.
The culture period may be changed as needed.
10.2.10 To keep the cell repeat the steps from 10.2.1 to 10.2.9.
12 © ISO 2019 – All rights reserved
10.3 Cell culture for the infectious virus titre assay
The cell culture in 6 wells plate or 96 wells microplate is required for the test of the plaque assay or
TCID method.
10.3.1 Put 20 ml of growth medium (9.7) in the culture medium container (7.27) and add 1ml of the
subcultured cell suspension of 10.2.6.
10.3.2 Put 3 ml of the cell suspension of 10.3.1 in each hole of the 6 wells plastic plate (7.22) for the
plaque assay test. Or put 0,1 ml of the cell suspension of 10.3.1 in each well of the 96 wells microplate
(7.21) for TCID method.
10.3.3 Put the 6 wells plate or the microplate in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and
keep it for several days to culture.
The culture period of 3 days to 5 days is usual and may be changed as needed.
10.3.4 Observe the condition of the cells by the inversed microscopy if the multiplied cells are confluent.
10.4 Preparation for test virus
10.4.1 General
The viruses are cryopreserved in the freezer, so the operation to defrost and to grow them for test is
required.
10.4.2 Influenza virus
10.4.2.1 Put the cryopreserved base virus in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it
for rapid defrosting.
10.4.2.2 Drain the growth medium from the flask of 10.2.9 with the cultured cells in the monolayer.
10.4.2.3 Add 5 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.2.2. Wash the surface of the
cultured cells and drain the maintenance medium. Repeat the washing procedure 2 times.
10.4.2.4 Prepare a new test tube.
10.4.2.5 Put the defrosted base influenza virus of 10.4.2.1 in the test tube of 10.4.2.4, dilute with the
3 4
maintenance medium (9.8) and adjust the concentration of virus to 10 PFU to 10 PFU or TCID /ml.
10.4.2.6 Inoculate 1 ml of the adjusted base influenza virus of 10.4.2.5 on the surface of cell in the flask
of 10.4.2.3 and spread to the whole surface.
10.4.2.7 Put the flask of 10.4.2.6 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 34 °C and keep it for 1 h
to adsorb the virus to the cells.
10.4.2.8 Put 20 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask (see 10.4.2.7) and add 30 μl of Trypsin
derived from beef pancreas and PBS (-) solution (9.11).
10.4.2.9 Put the flask in the CO incubator (7.24) at a temperature of 34 °C for 1 to 3 days to multiply the
influenza virus.
10.4.2.10 Observe the cytopathic effect by a microscope and judge the multiplication of influenza
virus. If the multiplication of influenza virus is confirmed, proceed to 10.4.2.11.
10.4.2.11 Put the multiplied virus suspension in the centrifugal tube.
10.4.2.12 Centrifuge the multiplied virus suspension of 10.4.2.11 by using a centrifuge at a
temperature of 4 °C and 1 000 × g for 15 min.
10.4.2.13 Take the supernatant suspension from the centrifugal tube after the centrifugation.
This is to be the influenza virus suspension. Divide the suspension into test tubes appropriately and
cryopreserve at −80 °C in the freezer (7.11) or −196 °C in the Liquid nitrogen bath (7.12).
10.4.2.14 Check the concentration of the virus if it is more than 10 PFU or TCID /ml by plaque
titre assay or TCID method. If the concentration is less than 10 PFU or TCID /ml, prepare it from
50 50
beginning.
10.4.2.15 Just before use, put the cryopreserved virus suspension of 10.4.2.14 in the water bath
(7.9) at a temperature of 37 °C and keep it for rapid defrosting.
10.4.2.16 This is to be the virus suspension for the test. If not used immediately, preserve in the
refrigerator at a temperature of 4 °C.
If needed, just before use, the virus suspension for the test of 10.4.2.16 could be proceeded with 10-fold
dilution using water (9.1) as diluent. The concentration of the virus suspension for the test after 10-fold
7 7
dilution should be adjusted to a titre of 1 × 10 PFU or TCID /ml to 5 × 10 PFU or TCID /ml.
50 50
10.4.3 Feline calicivirus
10.4.3.1 Put the cryopreserved base virus in the water bath (7.9) at a temperature of 37 °C and keep it
for rapid defrosting.
10.4.3.2 Drain the growth medium from the flask of 10.2.9 with the cultured cells in the monolayer.
10.4.3.3 Add 5 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.3.2. Wash the surface of the
cultured cells and drain the maintenance medium. Repeat the washing procedure 2 times.
10.4.3.4 Prepare a new test tube.
10.4.3.5 Put the defrosted base viruses in the test tube of 10.4.3.4, dilute by the maintenance medium
5 6
(9.8) and adjust the concentration of virus to 10 PFU to 10 PFU or TCID /ml.
The concentration of virus suspension may be changed as needed.
10.4.3.6 Inoculate 1 ml of the adjusted base viruses of 10.4.3.5 on the surface of the cultured cells in the
flask of 10.4.3.3 and spread to the whole surface.
10.4.3.7 Put the flask of 10.4.3.6 in the CO incubator (7.24) at a temperature of 37 °C and keep it for 1 h
to absorb the virus into the cells.
10.4.3.8 Add 20 ml of the maintenance medium (9.8) in the flask of 10.4.3.7.
The amount of the maintenance medium may be changed as needed.
14 © ISO 2019 – All rights reserved
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 18184
Deuxième édition
2019-06
Textiles — Détermination de l'activité
virucide de produits textiles
Textiles — Determination of antiviral activity of textile products
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Virus et cellule hôte . 3
6 Avertissement . 3
7 Appareillage . 3
8 Stérilisation de l’appareillage . 6
9 Réactif et milieu de culture . 6
10 Préparation .11
10.1 Restauration de la cellule hôte cryoconservée .11
10.2 Sous-culture de cellules hôtes .12
10.3 Culture cellulaire pour détermination du titre infectieux d’une suspension virale .13
10.4 Préparation du virus à soumettre à essai .13
10.4.1 Généralités .13
10.4.2 Virus Influenza .13
10.4.3 Calicivirus félin .14
10.4.4 Titre infectieux des virus soumis à essai .15
10.5 Préparation des éprouvettes .16
10.5.1 Tissu témoin .16
10.5.2 Préparation des éprouvettes .16
10.5.3 Stérilisation des éprouvettes .16
10.6 Essai témoin .17
10.6.1 Généralités .17
10.6.2 Vérification de la cytotoxicité par la sensibilité des cellules au virus et
l’inactivation de l’activité virucide .17
11 Mode opératoire d’essai.17
11.1 Préparation des éprouvettes .17
11.2 Dépôt du virus dans les éprouvettes .17
11.3 Durée de contact .18
11.4 Élimination du virus immédiatement après dépôt .18
11.5 Élimination du virus après la durée de contact .18
12 Préparation pour dilutions en série de la suspension virale .18
13 Détermination du titre infectieux .19
13.1 méthode des plages de lyse .19
13.2 Méthode DICT .
50 19
14 Calcul du titre infectieux .19
14.1 Méthode des plages de lyse .19
14.2 Méthode DICT .
50 19
14.2.1 Méthode de Behrens et Kärber .19
14.2.2 Exemple de calcul .20
14.3 Résultat d’essai .22
14.3.1 Vérification de cet essai.22
14.3.2 Calcul de la valeur de l’activité virucide .22
15 Rapport d’essai .22
Annexe A (informative) Souches virales et cellules hôtes .23
Annexe B (normative) Détermination du titre infectieux: méthode des plages de lyse .24
Annexe C (normative) Détermination du titre infectieux: méthode DICT .26
Annexe D (informative) Composition des milieux.27
Annexe E (informative) Méthode d’essai avec des œufs de poule fécondés exempts d’agents
pathogènes (SPF) .30
Annexe F (informative) Efficacité virucide — Performances virucides des produits .35
Annexe G (informative) Résultats des essais interlaboratoires (1) .36
Annexe H (informative) Résultats des essais interlaboratoires (2) .38
Bibliographie .41
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 38, Textiles.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 18184:2014), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— l’Article 1 a été mis à jour;
— à l’Article 5, les virus et les cellules hôtes mentionnés dans le présent document ont été remplacés
par des exemples d’espèces;
— en 10.6, « Vérification de l’effet cytotoxique » a été supprimé;
— en 11.1, « Préparation des éprouvettes » a été mis à jour;
— en 14.3.2, « Calcul de la valeur de l’activité virucide » a été mis à jour;
— l’Annexe E (Autre virus: virus de la poliomyélite) a été supprimée.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse https: //www .iso .org/fr/members .html.
Introduction
Au cours de ces dernières années, le niveau de vie de la population mondiale a connu une nette
amélioration et les consommateurs tendent aujourd’hui à rechercher des produits de soin ou de
protection de la santé. Cette tendance s’accompagne d’un intérêt accru de la population pour la
protection contre des maladies épidémiques, notamment dans les trains de banlieue bondés que les
voyageurs empruntent quotidiennement, dans les hôpitaux, dans les maisons médicalisées, etc.
Grâce à la récente accélération du développement de techniques ultra performantes pour le traitement
des produits textiles, les produits d’hygiène et de protection de la santé occupent une place de plus en
plus importante sur le marché.
Ces produits relativement nouveaux ont bénéficié des avancées techniques réalisées dans le domaine
des technologies textiles et les fabricants ont individuellement développé des méthodes d’essai afin
d’évaluer les performances des produits. Cependant, aucune méthode d’essai unifiée n’a été élaborée et
les consommateurs et les fabricants ne disposent à ce jour d’aucune information claire sur ces produits
hautement fonctionnels.
Les produits à propriétés virucides figurent parmi ces produits et intègrent les domaines techniques
des technologies textiles et des biotechnologies.
Dans ce contexte, la nécessité d’élaborer une Norme internationale s’impose aux consommateurs,
distributeurs, fabricants ou autres intervenants, en tant que parties prenantes de ce marché.
Les produits textiles à propriétés virucides sont des textiles capables de réduire le nombre de virus
infectieux qui entrent en contact avec leur surface. Le présent document établit une méthode d’essai
quantitative permettant d’évaluer les performances virucides de ces produits.
Les données objectives obtenues grâce au présent document permettent à tous les acteurs
(consommateurs, fabricants, distributeurs, etc.) de déterminer de manière correcte la performance des
produits textiles antiviraux.
Deux méthodes permettent de quantifier le nombre de virus infectieux (titre infectieux dans le présent
document): la méthode directe des plages de lyse et la méthode DICT . La méthode utilisée peut être
choisie en fonction de l’expertise et des capacités techniques de chaque centre d’essai. Tout système
cellulaire approprié peut être utilisé et il convient de consigner les conditions d’essai dans le rapport
d’essai.
Voir l'Annexes G et H pour les résultats des essais interlaboratoires.
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 18184:2019(F)
Textiles — Détermination de l'activité virucide de produits
textiles
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes d’essai permettant d’évaluer l’activité virucide des produits
textiles contre des virus spécifiés. En raison des différences de sensibilité, les résultats obtenus avec un
virus d’essai ne peuvent pas être transposés à d’autres virus.
Les produits textiles incluent les tissus, les tricots, les fibres, les fils, les tresses, etc.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 105-F02, Textiles — Essais de solidité des teintures — Partie F02: Spécifications pour les tissus témoins
en coton et en viscose
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
virus
entité biologique originale qui possède un unique type d’acide nucléique (ADN ou ARN), une structure
spécifique qui oppose le virus aux organismes vivants possédant une structure cellulaire (procaryotes
et eucaryotes) et qui se reproduit par réplication à partir de son matériel génétique à l’intérieur de la
cellule hôte pour conduire à un parasitisme intracellulaire absolu
Note 1 à l'article: La particule virale infectieuse est appelée virion.
3.2
activité virale
capacité d’un virus à se répliquer dans les cellules hôtes sensibles et permissives
3.3
activité virucide
propriété de toute substance (chimique ou non) entraînant une modification d’un des éléments de la
structure du virion qui induit l’incapacité de ce dernier à se répliquer
Note 1 à l'article: Il s’agit d’une propriété qui réduit l’activité virale, généralement par une modification
morphologique ou une altération structurelle de la surface protéique du virus.
Note 2 à l'article: La modification de la réponse antigénique ou la modification d’un élément constitutif n’implique
pas nécessairement une diminution de la virulence d’un virus.
3.4
substances chimiques virucides
substances chimiques inorganiques ou organiques capables de réduire l’activité virale (3.2)
Note 1 à l'article: Les substances chimiques virucides organiques modifient la surface protéique du virus par
adsorption chimique. Les substances virucides métalliques inorganiques détruisent ou modifient la morphologie
du virus par arrachement d’un atome d’hydrogène de la protéine virale, grâce à des radicaux OH générés par
réaction radicalaire.
3.5
tissu témoin
tissu utilisé pour vérifier la stabilité du virus soumis à essai sur une étoffe textile
Note 1 à l'article: Il convient d’utiliser les tissus avant traitement virucide comme tissu témoin dans les mêmes
conditions que celles décrites en 3.5.
Note 2 à l'article: En l’absence de tissu témoin comme décrit dans la Note 1, il convient d’utiliser le tissu 100 % coton
décrit dans l’ISO 105-F02 sans traitement chimique (blanchiment optique, etc.).
3.6
essai témoin
essai destiné à vérifier qu’une éprouvette n’a aucune influence sur la cellule hôte
Note 1 à l'article: Cet essai est effectué dans les mêmes conditions que l’essai réel, mais sans le virus.
Note 2 à l'article: Également appelé essai témoin d’une éprouvette.
3.7
effet cytopathogène
effet cytopathogène (ECP) du virus
effet qui se manifeste sous la forme d’une altération morphologique ou d’une destruction des cellules
hôtes provoquée par la multiplication des virus
3.8
titre infectieux du virus
nombre de particules virales infectieuses présent par unité de volume dans un lysat cellulaire ou dans
une suspension virale
3.9
plage de lyse
surface de cellules lysées dans une culture cellulaire monocouche
3.10
unité formant plage
UFP
unité exprimée en concentration de virus infectieux par unité de volume
3.11
méthode des plages de lyse
méthode destinée à déterminer le titre infectieux du virus (3.8) à partir du nombre d’UFP en utilisant
des dilutions successives
3.12
DICT
dose infectieuse à 50 % d’une suspension virale de rinçage ou d’une dilution de suspension virale qui
induit un ECP dans 50 % des cultures cellulaires
Note 1 à l'article: Voir 3.7.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
3.13
méthode DICT
méthode destinée à déterminer le titre infectieux du virus (3.8) à partir de la DICT en utilisant des
dilutions successives
3.14
cytotoxicité
altération morphologique des cellules et/ou leur destruction ou la réduction de leur sensibilité à la
multiplication de virus induite par un produit
4 Principe
Les virus sont déposés sur une éprouvette. Une fois le temps de contact écoulé, la quantité restante du
virus infectieux est déterminée et le taux de réduction est calculé en comparant l’éprouvette d’essai
du produit virucide et l’éprouvette témoin sur une échelle logarithmique décimale. Deux méthodes
permettent de quantifier le titre infectieux d’un virus. La première est la méthode des plages de lyse et
l’autre la méthode DICT . Le choix de la méthode est fonction de l’expertise et des capacités du centre
d’essai.
5 Virus et cellule hôte
L’Annexe A donne des exemples d’espèces virales et de cellules hôtes.
Il est possible d’employer d’autres espèces virales et d’autres cellules hôtes après validation appropriées
car le virus important peut changer en fonction de l’application cible. Si d’autres espèces sont utilisées, le
nom de l’espèce et la raison spécifique de son utilisation doivent être consignés dans le rapport d’essai.
NOTE La liste des virus de référence est donnée dans l’EN 14476 et dans l’EN 14675.
6 Avertissement
Le présent document nécessite l’utilisation de virus infectieux ou de substances et/ou modes opératoires
qui peuvent être préjudiciables à la santé et à l’environnement si les conditions appropriées ne sont pas
respectées. Elle se réfère uniquement à l’aptitude technique et ne dispense nullement l’utilisateur de
satisfaire, à tout moment, aux obligations légales en matière de santé, de sécurité et d’environnement.
L’avertissement est également applicable aux éléments suivants. Le virus utilisé dans le cadre de la
présente norme doit être un virus de niveau de sécurité biotechnologique de classe II, désigné comme
tel par les directives de l’OMS. L’utilisateur du présent document doit disposer de connaissances et d’une
expertise suffisantes en matière de microbiologie. Par ailleurs, les utilisateurs doivent rigoureusement
se conformer à la norme de sécurité des fabricants et à la réglementation locale applicable.
7 Appareillage
7.1 Stérilisateur sous vapeur à haute pression: autoclave capable de fonctionner à une température
de (121 ± 2) °C.
NOTE L’autoclave est décrit dans l’EN 12353.
7.2 Stérilisateur à chaleur sèche: fours capables de fonctionner à des températures de (180 ± 2) °C
et de (160 ± 2) °C.
NOTE Les fours à air chaud sont décrits dans l’EN 12353.
7.3 Fiole jaugée d’une capacité de 1 l.
7.4 Balance offrant une plage de mesure de 0,01 g à 100 g avec une précision de 1,0 %.
7.5 Pipettes de différents volumes avec une précision de 10 % du volume nominal.
7.6 Machine à laver.
7.7 Pipeteur capable de recevoir les pipettes en verre ou en plastique.
7.8 Micropipette de volume parfaitement adapté à chaque utilisation, à extrémité en verre ou en
plastique, avec une tolérance inférieure ou égale à 0,5 %.
7.9 Bain-marie capable de maintenir des températures de (37 ± 1) °C, (50 ± 1) °C et (56 ± 1) °C.
1)
7.10 Agitateur de type Vortex® utilisé pour les essais microbiens.
7.11 Congélateur réglable à une température de (–80 ± 2) °C ou (–20 ± 2) °C.
7.12 Bain d’azote liquide pour la conservation à –196 °C environ.
7.13 Appareil de filtration sur membrane avec un diamètre de pore de 0,22 μm.
7.14 Réfrigérateur réglable à une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
7.15 pH-mètre avec incertitude d’étalonnage ± 0,1 unité de pH à (20 ± 1) °C.
NOTE Les pH-mètres sont décrits dans l’EN 12353.
7.16 Microscope inversé pour l’observation des cultures cellulaires.
7.17 Pinces stérilisables.
7.18 Centrifugeuse réglable à une température de (4 ± 2) °C et générant une force centrifuge relative
d’environ 1 000 g.
7.19 Poste de sécurité biologique de classe II.
7.20 Flacon d’une capacité de 30 ml avec bouchon à vis. Le joint est en tétrafluoroéthylène ou en
silicone, et le bouchon en polypropylène.
7.21 Microplaque à 96 puits à stérilisation par rayonnement gamma pour la méthode DICT .
Des microplaques à 96 puits avec d’autres traitements de stérilisation peuvent être utilisées après
validation appropriée de la croissance cellulaire. Voir la Figure 1.
1) Ces informations sont données aux utilisateurs du présent document à titre indicatif et ne constituent en
aucun cas une recommandation de l’ISO pour les produits concernés.
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Figure 1 — Microplaque à 96 puits pour la méthode DICT50
7.22 Plaque en plastique à 6 puits à stérilisation par rayonnement gamma pour la méthode des
plages de lyse.
Des plaques à 6 puits avec d’autres traitements de stérilisation peuvent être utilisées après validation
appropriée de la croissance cellulaire. Voir la Figure 2.
Figure 2 — Plaque en plastique à 6 puits pour la méthode des plages de lyse
7.23 Fiole pour la culture cellulaire, stérilisée aux rayonnements gamma, traitée pour faciliter
l’adhérence cellulaire, avec une zone de culture cellulaire de 75 cm et un bouchon d’aération. Le bouchon
d’aération peut laisser passer de l’air sans bactéries par un filtre à pores de 0,2 μm. Voir la Figure 3.
Une fiole avec d’autres traitements de stérilisation peut être utilisée après validation appropriée de la
croissance cellulaire.
Figure 3 — Fiole pour culture cellulaire
7.24 Incubateur à CO capable de maintenir une atmosphère contenant 5 % de CO à une température
2 2
de (34 ± 1) °C et de (37 ± 1) °C.
NOTE Certains incubateurs à CO sont décrits dans l’EN 12353.
7.25 Incubateur capable de maintenir une température de (25 ± 1) °C, (35 ± 1) °C et (37 ± 1) °C.
NOTE Certains incubateurs sont décrits dans l’EN 12353.
7.26 Tube à centrifuger.
7.27 Boîte de culture cellulaire.
7.28 Tube à essai.
7.29 Bécher.
8 Stérilisation de l’appareillage
Stériliser tous les équipements destinés à entrer en contact avec les cellules, les substances chimiques
ou les éprouvettes. La stérilisation doit être effectuée à la vapeur d’eau ou par chaleur sèche.
— Stérilisation à la vapeur d’eau: en autoclave (7.1) à une température de 121 °C et une pression
de 103 kPa pendant 15 min.
— Stérilisation par chaleur sèche: en stérilisateur à chaleur sèche (7.2) à une température de 180 °C
pendant 30 min ou à 160 °C pendant 2 h.
Pour les produits en plastique, des articles résistants à la chaleur ou stérilisés peuvent être utilisés.
9 Réactif et milieu de culture
Tous les réactifs doivent être d’une qualité adaptée aux besoins virologiques, c’est-à-dire sans substance
toxique pour les essais microbiens. Certains milieux de culture sont disponibles dans le commerce.
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9.1 Eau qui doit être de qualité analytique pour la préparation de milieux de culture microbiologiques,
qui est fraîchement distillée ou traitée par échange d’ions, par ultrafiltration ou par osmose inverse ou
toute combinaison de ces méthodes.
9.2 Milieu minimum essentiel de Eagle (EMEM), milieu du Roswell Park Memorial Institute
(RPMI), disponible dans le commerce. La composition de ce milieu est décrite à l’Annexe D. Si des
composants du milieu sont manquants, les ajouter conformément au tableau présentant la composition.
9.3 Solution de bicarbonate de sodium à 7,5 %.
9.3.1 Stériliser à l’autoclave 75 g de bicarbonate de sodium dans une boîte de culture cellulaire fermée
par un bouchon étanche.
9.3.2 Stériliser également l’eau à l’autoclave.
9.3.3 Dissoudre correctement le bicarbonate de sodium dans 1 000 ml d’eau stérilisée.
Une autre préparation (remplaçant 9.3.1, 9.3.2 et 9.3.3) est possible comme suit. Préparer la solution
de bicarbonate de sodium à 7,5 % par dissolution de 75 g de bicarbonate sodium dans 1 000 ml d’eau.
Stériliser la solution par filtration sur membrane de 0,22 μm.
9.4 Solution de formaldéhyde.
Préparer une solution aqueuse de formaldéhyde à 3,7 %.
L’autre solution de fixation cellulaire peut être utilisée après validation appropriée de la fixation
cellulaire.
9.5 Solution de bleu de méthylène.
9.5.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— eau, 1 000 ml;
— bleu de méthylène, 0,375 g;
— solution d’hydroxyde de sodium à 1 mol/l, 62,5 μl.
9.5.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.6 Sérum de veau fœtal (SVF) inactivé
9.6.1 Plonger le sérum de veau fœtal congelé cryoconservé, encore dans son emballage, dans un bain-
marie (7.9) maintenu à 37 °C, jusqu’à décongélation.
9.6.2 Relever ensuite la température du bain-marie à 56 °C et maintenir pendant 30 min pour inactiver.
9.6.3 Répartir le sérum dans plusieurs tubes. Placer les tubes dans le congélateur (7.11) à une
température inférieure à –20 °C jusqu’à l’utilisation pour les essais.
9.6.4 Juste avant utilisation, placer le sérum dans un bain-marie à 37 °C et l’y maintenir jusqu’à
décongélation.
9.7 Milieu de croissance.
9.7.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— eau, 800 ml;
— sulfate de kanamycine, 60 mg;
— milieu minimum essentiel d’Eagle (EMEM)(D.2), 9,53 g, ou milieu RPMI 1640 (D.3), 10,4 g.
9.7.2 Dissoudre et bien mélanger, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml avec de l’eau.
9.7.3 Stériliser la solution mélangée de 9.7.2 à l’aide d’un filtre 0,22 μm (7.13).
9.7.4 Ajouter 15 ml de solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3) et 100 ml de sérum de veau
fœtal inactivé (9.6) à la solution de 9.7.3.
9.8 Milieu de conservation.
9.8.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— eau, 800 ml;
— sulfate de kanamycine, 60 mg;
— milieu minimum essentiel d’Eagle, 9,53 g.
9.8.2 Bien dissoudre les différents composants, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml
avec de l’eau.
9.8.3 Stériliser la solution mélangée de 9.8.2 à l’aide d’un filtre 0,22 µm (7.13).
9.8.4 Ajouter 15 ml de solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3) à la solution de 9.8.3.
9.9 Double concentration du milieu de conservation (9.8).
9.9.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— eau, 800 ml;
— sulfate de kanamycine, 120 mg;
— milieu minimum essentiel d’Eagle, 19,06 g.
9.9.2 Bien dissoudre les différents composants, puis compléter le volume total de la solution à 1 000 ml
avec de l’eau.
9.9.3 Stériliser la solution mélangée de 9.9.2 à l’aide d’un filtre 0,22 µm (7.13).
9.10 Solution saline tamponnée au phosphate (STP) 0,01 mol/l (-).
9.10.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— chlorure de sodium, 8 g;
— chlorure de potassium, 0,2 g;
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— hydrogénophosphate disodique 12 H O, 2,9 g;
— dihydrogénophosphate de potassium, 0,2 g.
9.10.2 Ajouter de l’eau pour compléter le volume total à 1 000 ml et bien dissoudre.
9.10.3 Transvaser ensuite la solution (9.10.2) dans une boîte de culture cellulaire puis stériliser la
solution de 9.10.2 à l’autoclave (7.1) à la température de 121 °C pendant 15 min.
9.11 Trypsine pancréatique bovine et solution STP (-).
9.11.1 Préparer un bécher, puis y placer les substances suivantes:
— solution saline tamponnée au phosphate (STP) (-) 0,01 mol/l (9.10), 100 ml;
— trypsine pancréatique bovine, 1,0 g.
9.11.2 Dissoudre et bien mélanger à l’aide d’un agitateur pendant deux heures.
9.11.3 Stériliser ensuite la solution de 9.11.2 avec un filtre 0,22 µm (7.13).
Les tubes dans lesquels la solution a été répartie et qui ne sont pas utilisés immédiatement sont conservés
dans le congélateur à une température inférieure à −80 °C jusqu’à leur utilisation pour les essais.
9.11.4 Préparer un tube à essai et y ajouter les solutions suivantes:
— solution saline tamponnée au phosphate (STP) (-) 0,01 mol/l (9.10), 9 ml;
— solution mélangée contenant de la trypsine pancréatique bovine et la solution STP (-) de 9.11.3, 1 ml.
9.11.5 Dissoudre et mélanger soigneusement.
9.11.6 Répartir la solution dans plusieurs tubes à essai et conserver ces tubes dans le congélateur à une
température inférieure à −20 °C jusqu’à leur utilisation pour les essais.
9.11.7 Juste avant utilisation, placer les tubes au bain-marie (7.9) à 37 °C et les y maintenir jusqu’à
décongélation.
9.12 Solution de trypsine/EDTA.
9.12.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— solution saline tamponnée au phosphate (STP) (-) 0,01 mol/l (9.10), 1 000 ml;
— trypsine, 2,5 g;
— sulfate de kanamycine, 0,1 g;
— sulfate de streptomycine, 0,1 g;
— amphotéricine B, 2 mg;
— acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,014 mol.
9.12.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.12.3 Stériliser ensuite la solution de 9.12.2 avec un filtre 0,22 µm (7.13).
9.12.4 Répartir la solution dans plusieurs tubes à essai et conserver ces tubes dans le congélateur à une
température inférieure à −20 °C jusqu’à leur utilisation pour les essais.
9.12.5 Avant utilisation, placer le tube à essai au bain-marie (7.9) à 37 °C jusqu’à décongélation
complète.
La solution de trypsine/EDTA est disponible dans le commerce. Les produits contenant les différents
composants de 9.12.1 peuvent être employés à l’issue d’un processus de validation adapté.
9.13 Solution de DEAE/dextrane.
9.13.1 Préparer une fiole jaugée (7.3) de 1 l puis y ajouter les substances suivantes:
— eau, 1 000 ml;
— diéthylaminoéthyl (DEAE)/dextrane, 20 g.
9.13.2 Dissoudre et bien mélanger.
9.13.3 Stériliser la solution de 9.13.2 avec un filtre 0,22 µm (7.13).
9.14 Préparation du milieu gélosé.
Le milieu gélosé se prépare avec le liquide A (9.14.1) et le liquide B (9.14.2) Il est mélangé juste avant son
utilisation (9.14.3).
9.14.1 Liquide A.
9.14.1.1 Préparer une boîte de culture cellulaire stérilisée (7.27) de 1 l puis y ajouter les composants
suivants:
— double concentration du milieu de conservation (9.9), 1 000 ml;
— solution de DEAE/dextrane (9.13), 10 ml;
— solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % (9.3), 40 ml.
Bien mélanger.
9.14.1.2 Uniquement pour les essais avec le virus influenza et pour la méthode des plages de lyse,
ajouter 3,0 ml de la solution de trypsine pancréatique bovine et de STP (-) (9.11).
9.14.1.3 Placer la solution de 9.14.1.1 ou de 9.14.1.2 dans le bain-marie (7.9) à 37 °C et l’y maintenir
jusqu’à utilisation.
9.14.2 Liquide B.
9.14.2.1 Préparer une boîte de culture cellulaire (7.27) de 2 l puis y ajouter les composants suivants:
— eau, 1 000 ml;
— agar pour culture cellulaire, 15 g.
Bien mélanger.
9.14.2.2 Stériliser la solution mélangée de 9.14.2.1 dans l’autoclave (7.1) à 121 °C et à une pression
de 103 kPa pendant 15 min.
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9.14.2.3 Placer la solution de 9.14.2.2 dans le bain-marie (7.9) à 50 °C et l’y maintenir jusqu’à utilisation.
9.14.3 Mélanger le liquide A et le liquide B à parts égales (vol/vol).
9.15 Milieu SCDLP utilisé pour le rinçage et la suppression de l’activité de l’agent du produit textile traité.
9.15.1 Préparer une boîte de culture cellulaire (7.27) de 1 l puis y ajouter les composants suivants:
— eau, 1 000 ml;
— peptone de caséine, 17,0 g;
— peptone de soja, 3,0 g;
— chlorure de sodium, 5,0 g;
— hydrogénophosphate dipotassique, 2,5 g;
— D-Glucose, 2,5 g;
— lécithine 1,0 g.
Mélanger et bien dissoudre, puis ajouter:
— tensioactif non ionique (Tween 80), 7,0 g.
Dissoudre et bien mélanger.
9.15.2 Ajuster ensuite le pH de la solution de 9.15.1 à 7,0 ± 0,2 en ajoutant la solution d’hydroxyde de
sodium ou d’acide chlorhydrique dans le bain-marie (7.9) à 25 °C.
9.15.3 Stériliser la solution mélangée de 9.15.2 dans l’autoclave (7.1) à 121 °C et à une pression
de 103 kPa pendant 15 min.
9.16 Milieu de conservation avec trypsine.
9.16.1 Préparer une boîte de culture cellulaire stérilisée (7.27) de 1 l puis y ajouter les composants
suivants:
— milieu de conservation (9.8), 1 000 ml;
— trypsine pancréatique bovine et solution STP(-) (9.11), 3,0 ml.
Bien dissoudre.
10 Préparation
10.1 Restauration de la cellule hôte cryoconservée
10.1.1 Placer la cellule hôte cryoconservée au bain-marie (7.9) à 37 °C et l’y maintenir pour une
décongélation rapide.
10.1.2 Préparer une nouvelle fiole pour cultures cellulaires (7.23) avec bouchon d’aération et
ajouter 20 ml de milieu de croissance (9.7) dans la fiole.
10.1.3 Verser une ampoule complète de cellules hôtes décongelées de 10.1.1 dans la fiole.
10.1.4 Placer la fiole dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C pendant (24 ± 2) h pour la mise en culture
des cellules hôtes.
10.1.5 Examiner ensuite la fiole de 10.1.4 au microscope pour déterminer si les cellules sont fixées au
fond de la fiole.
Si la croissance cellulaire est confirmée, passer à l’étape suivante. Si elle ne l’est pas, maintenir la fiole
dans l’incubateur.
10.1.6 Retirer le milieu de croissance restant de la fiole de 10.1.5.
10.1.7 Ajouter 20 ml de milieu de croissance frais (9.7) dans la fiole de 10.1.6.
10.1.8 Placer la fiole de 10.1.7 dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C pendant (48 ± 2) h.
10.1.9 Observer ensuite la fiole de 10.1.8 au microscope et vérifier que les cellules mises en culture
confluent en nappe au fond de la fiole. Si la croissance des cellules est insuffisante, reprendre l’étape 10.1.8
jusqu’à obtention d’une croissance suffisante.
10.1.10 Effectuer ensuite une sous-culture en série en exécutant les étapes de 10.2.
10.2 Sous-culture de cellules hôtes
10.2.1 Retirer l’excédent de milieu de croissance de la fiole une fois l’étape 10.1.8 achevée.
10.2.2 Ajouter 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (STP) (-) 0,01 mol/l (9.10) et l’utiliser
pour rincer la surface de la culture cellulaire au fond de la fiole. Retirer l’excédent de solution STP (-).
Renouveler 3 fois le rinçage.
10.2.3 Ajouter 0,5 ml de solution de Trypsine/EDTA (9.12) dans la fiole de 10.2.2 et étaler cette solution
sur toute la surface.
10.2.4 Placer la fiole de 10.2.3 dans l’incubateur à CO (7.24) à 37 °C pendant 10 min ± 1 min pour la
maintenir au chaud.
10.2.5 Observer la fiole de 10.2.4 à l’œil nu afin de déterminer si les cellules en culture commencent à se
détacher. Si c’est le cas, tapoter le côté de la fiole pour disperser les cellules.
10.2.6 Ajouter 5 ml de milieu de croissance (9.7) dans la fiole de 10.2.5. Pipeter délicatement le milieu
pour bien le mélanger et éviter d’endommager les cellules.
10.2.7 Préparer une nouvelle fiole pour cultures cellulaires (7.23) et ajouter 20 ml de milieu de
croissance (9.7).
10.2.8 À l’aide d’une pipette, ajouter 1 ml de suspension cellulaire de 10.2.6 à la fiole de 10.2.7.
La quantité de suspension cellulaire de 10.2.6 peut être modifiée selon les besoins.
10.2.9 Fermer le bouchon de la fiole de 10.2.8 et placer cette dernière dans l’incubateur à CO (7.24)
à 37 °C pour 5 jours de mise en culture.
La période de mise en culture peut être modifiée selon les besoins.
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10.2.10 Reprendre les étapes de 10.2.1 à 10.2.9 pour conserver les cellules.
10.3 Culture cellulaire pour détermination du titre infectieux d’une suspension virale
Réaliser la culture cellulaire dans une plaque à 6 puits pour la méthode des plages de lyse ou dans une
microplaque à 96 puits pour la méthode DICT .
10.3.1 Placer 20 ml de milieu de croissance (9.7) dans la boîte de culture cellulaire (7.27) et y
ajouter 1 ml de la suspension cellulaire en sous-culture de 10.2.6.
10.3.2 Pour la méthode des plages de lyse, placer 3 ml de la suspension cellulaire de 10.3.1 dans chaque
puits de la plaque en plastique à 6 puits (7.22). Pour la méthode DICT , placer 0,1 ml de la suspension
cellulaire de 10.3.1 dans chaque puits de la microplaque à 96 puits (7.21).
10.3.3 Placer la plaque à 6 puits dans l’incubateur à CO (7.24) à une température de 37 °C. La maintenir
dans l’incubateur pendant plusieurs jours pour la mise en culture.
La période de culture couramment utilisée est comprise entre 3 jours et 5 jours et peut être adaptée en
fonction des besoins.
10.3.4 Vérifier au microscope inversé la multiplication et la confluence des cellules.
10.4 Préparation du virus à soumettre à essai
10.4.1 Généralités
Les virus étant cryoconservés dans le congélateur, il faut les décongeler et les mettre en culture pour
l’essai.
10.4.2 Virus Influenza
10.4.2.1 Placer la base virale cryoconservée au bain-marie (7.9) à 37 °C et l’y maintenir pour une
décongélation rapide.
10.4.2.2 Retirer le milieu de croissance de la fiole de 10.2.9 contenant la monocouche de cellules en
culture.
10.4.2.3 Ajouter 5 ml de milieu de conservation (9.8) dans la fiole de 10.4.2.2. Rincer la surface des
cellules en culture et retirer le milieu de conservation. Renouveler 2 fois le rinçage.
10.4.2.4 Préparer un nouveau tube à essai.
10.4.2.5 Placer le virus Influenza décongelé de 10.4.2.1 dans le tube à essai de 10.4.2.4, diluer avec du
3 4
milieu de conservation (9.8) et ajuster la concentration du virus de 10 UFP à 10 UFP ou DICT /ml.
10.4.2.6 Inoculer 1 ml du virus Influenza ajusté de 10.4.2.5 sur la surface cellulaire dans la fiole
de 10.4.2.3 et étaler sur toute la surface.
10.4.2.7 Placer la fiole de 10.4.2.6 dans l’incubateur à CO (7.24) à 34 °C pendant 1 heure pour permettre
l’adsorption du virus par les cellules.
10.4.2.8 Placer 20 ml de milieu de conservation (9.8) dans la fiole (voir 10.4.2.7) et ajouter 30 μl de
solution mélangée de tryps
...
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