ISO 21286:2019
(Main)Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding
This document specifies a protocol to identify ecotoxicological test specimens (mainly invertebrates and plants) to the species level, based on the DNA barcoding technique. This protocol can be used by laboratories performing DNA barcoding in order to standardize both the wet-lab and data analysis workflows as much as possible, and make them compliant with community standards and guidelines. This document does not intend to specify one particular strain for each test method, but to accurately document the species/strain which was used. NOTE 1 This does not imply that DNA barcoding is performed in parallel to each test run, but rather regularly (e.g. once a year, such as reference substance testing) and each time a new culture is started or new individuals are added to an ongoing culture. This document does not aim at duplicating or replacing morphological-based species identifications. On the contrary, DNA barcoding is proposed as a complementary identification tool where morphology is inconclusive, or to diagnose cryptic species, in order to ensure that the results obtained from different ecotoxicological laboratories are referring to the same species or strain. This document is applicable to identifications of immature forms which lack morphological diagnostic characters (eggs, larvae, juveniles), as well as the streamline identification of specimens collected in field monitoring studies, where large numbers of organisms from diverse taxa are classified. NOTE 2 In principle, all species regularly used in ecotoxicological testing can be analysed by DNA barcoding. Besides the earthwoms Eisenia fetida and E. andrei, further examples for terrestrial species are Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, and A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus, and E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta, and Sinella curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer and Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata and Poecilus cupreus (Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) or Pardosa sp. (Arachnida). Nematodes or snails and even plants can also be added to this list.
Qualité du sol — Identification des espèces par codes-barres ADN dans les essais d'écotoxicologie
Le présent document spécifie un protocole d'identification de spécimens d'essais écotoxicologiques (principalement des invertébrés et des végétaux) au niveau de l'espèce, reposant sur la technique du code-barres ADN. Ce protocole peut être utilisé par les laboratoires effectuant le code-barres ADN afin de normaliser le plus possible les travaux de laboratoire et les flux d'analyse de données, et de les mettre en conformité avec les normes et les lignes directrices communautaires. Le présent document ne prévoit pas de spécifier une souche particulière pour chaque méthode d'essai, mais de documenter avec exactitude l'espèce/la souche qui a été utilisée. NOTE 1 Cela ne veut pas dire que le code-barres ADN est effectué parallèlement à chaque cycle d'essai, mais qu'il est effectué régulièrement (par exemple, une fois par an, notamment pour l'essai mené avec la substance de référence) et à chaque fois qu'une nouvelle culture est démarrée ou que de nouveaux individus sont ajoutés à une culture existante. Le présent document ne vise pas à reproduire ou remplacer les identifications d'espèces reposant sur des caractéristiques morphologiques. En revanche, le code-barres ADN est proposé comme outil d'identification complémentaire lorsque l'identification morphologique est incertaine, ou pour diagnostiquer les espèces cryptiques, afin d'assurer que les résultats obtenus auprès de différents laboratoires d'écotoxicologie font référence à la même espèce ou souche. Le présent document est applicable à l'identification de formes immatures n'ayant pas de caractéristiques morphologiques de diagnostic (œufs, larves, juvéniles) ainsi qu'à l'identification rationalisée des spécimens prélevés lors d'études de surveillance sur le terrain, où un grand nombre d'organismes de taxons divers sont classés. NOTE 2 En principe, toutes les espèces régulièrement utilisées lors des essais écotoxicologiques peuvent être analysées par code-barres ADN. Outre les vers de terre Eisenia fetida et E. andrei, d'autres exemples d'espèces terrestres sont Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus et E. crypticus (Haplotaxida) ; Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta et Sinella curviseta (Collembola) ; Hypoaspis aculeifer et Oppia nitens (Acari) ; Aleochara bilineata et Poecilus cupreus (Coleoptera) ; Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) ou Pardosa sp. (Arachnida). De plus, les nématodes ou les escargots et même les plantes peuvent être ajoutés à cette liste non exhaustive.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21286
First edition
2019-03
Soil quality — Identification of
ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Qualité du sol — Identification des espèces par code-bare ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and material . 3
5.1 Biological material . 3
5.2 Enzyme . 3
5.3 Oligonucleotide PCR primers . 3
5.4 Reagents. 3
6 Apparatus . 4
7 General requirements . 5
7.1 Experimental precaution and contamination avoidance . 5
7.2 Safety precautions . 5
7.2.1 Chemical hazards. 5
7.2.2 Physical hazards . 6
8 Procedure. 6
8.1 DNA isolation . 6
8.2 Quantification . 7
8.3 PCR . 7
8.3.1 Target genomic region . 7
8.3.2 Primer design . 7
8.3.3 Primer synthesis . 7
8.3.4 PCR . 8
8.4 Checking the amplicon size . 9
8.5 Purification . 9
8.6 Sequencing . 9
8.7 Bioinformatics . 9
8.7.1 General. 9
8.7.2 Electropherogram or raw sequence quality checking .10
8.7.3 Trimming of low-quality regions and primers sequences .10
8.7.4 Sequence overlapping .10
8.7.5 Sequence verification . .11
8.7.6 Reviewing the edited sequence .11
8.7.7 Species assignment .11
8.7.8 Quality of the reference databases .12
9 Calculation and expression of results .13
10 Validity of the test .13
11 Test report .14
Annex A (informative) Eisenia Barcoding Initiative: A ring test to evaluate the applicability
of DNA barcoding for the identification of Eisenia species .15
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
Currently, test species identification is usually based on morphological characters. However, this does
not always give clear results because
a) few taxonomic experts are available,
b) closely related species can differ by a few, easily overlooked characters, and
c) even more importantly, several test species are in fact complexes of cryptic species.
A good example is the compost worm Eisenia fetida/andrei (used in ISO 11268-1, ISO 11268-2 and
ISO 17512-1), in which morphological traits alone may not be sufficient to discriminate between both
[5][36] [50]
species . Another well-known case is the predatory mite, Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer ,
[31]
which might get confused with H. miles, widely used in biological pest control .
Species misidentifications, the use of a morphospecies which is actually a complex of cryptic species, or
even species mixing in lab cultures, can be a serious problem for the reliability of the ecotoxicological
tests. Sibling species in a morphospecies complex can exhibit ecological, behavioural, and physiological
differences, and can differ also in their response to toxicants (e.g. References [2], [17], [35], [40]). This
also seems to be the case of the springtail Folsomia candida (used in ISO 11267 and ISO 17512-2), in
which considerable levels of genetic differentiation have been found among natural populations of F.
[9][19][41]
candida and among laboratory strains . Although different laboratory strains have been found
[12][9]
to exhibit only minor differences in the sensitivity towards some chemicals , other studies have
detected significant variation in phenmedipham avoidance behaviour and divergent fitness responses
[14][30]
to cadmium exposure among genetically differentiated strains . Moreover, even if two species
have similar responses to toxicants, the presence of two species within the same laboratory culture can
[36]
result in the production of sterile hybrids, which will bias the outcome of reproduction tests .
Implementing species identification via DNA barcoding can help to overcome these obstacles, ensuring
that the species or strain used for testing is well characterized. As a result, quality assurance can be
improved, making the results obtained by different ecotoxicological laboratories far more reliable and
comparable. For Eisenia fetida/E. andrei this work, including an international ringtest, has already been
[36]
performed , see Annex A. The conclusions of this ringtest can be summarized as follows.
— DNA barcoding is a reliable and practical method for identifying Eisenia species.
— Only 17 out of 28 ecotoxicological laboratories were correct in their taxonomic assignment. Most
laboratories with wrong or unknown assignments actually have E. andrei in stock.
— The existence of a cryptic species pair within E. fetida is a plausible hypothesis.
— It is important that earthworms used for ecotoxicological tests are regularly (re-)identified by DNA
barcoding.
Very probably, similar experiences and recommendations can b
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21286
Première édition
2019-03
Version corrigée
2019-12
Qualité du sol — Identification des
espèces par codes-barres ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériel . 3
5.1 Matériel biologique . 3
5.2 Enzyme . 3
5.3 Amorces oligonucléotidiques de PCR . 4
5.4 Réactifs . 4
6 Appareillage . 5
7 Exigences générales . 5
7.1 Précautions expérimentales et prévention de la contamination . 5
7.2 Précautions de sécurité . 6
7.2.1 Dangers chimiques . . 6
7.2.2 Dangers physiques . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Isolement de l’ADN . 6
8.2 Quantification . 7
8.3 PCR . 7
8.3.1 Région génomique cible . 7
8.3.2 Désignation d’amorces . 7
8.3.3 Synthèse d’amorces . 8
8.3.4 PCR . 8
8.4 Contrôle de la taille des amplicons . 9
8.5 Purification . 9
8.6 Séquençage .10
8.7 Bioinformatique .10
8.7.1 Généralités .10
8.7.2 Contrôle qualité des électrophorégrammes ou des séquences brutes .10
8.7.3 Rognage des séquences de faible qualité et des amorces .11
8.7.4 Assemblage des séquences .11
8.7.5 Vérification des séquences .11
8.7.6 Contrôle de la séquence éditée .11
8.7.7 Assignation des espèces .12
8.7.8 Qualité des bases de données de référence .13
9 Calcul et expression des résultats .14
10 Validité de l’essai .14
11 Rapport d'essai .15
Annexe A (informative) Initiative du code-barres ADN d’Eisenia: essai interlaboratoires
visant à évaluer l’applicabilité du code-barres ADN dans le cadre de l’identification
de l’espèce Eisenia . .16
Bibliographie .19
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
La présente version corrigée de l’ISO 21286:2019 inclut la correction suivante: le titre du document a
été corrigé en remplaçant «code-bare» par «codes-barres».
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Actuellement, l’identification des espèces utilisées pour des essais standardisés repose généralement
sur des caractéristiques morphologiques. Toutefois, ceci ne permet pas toujours d’obtenir des résultats
clairs car:
a) peu de taxonomistes sont disponibles,
b) des espèces très ressemblantes peuvent différer au niveau de quelques caractéristiques facilement
ignorées, et
c) surtout, plusieurs espèces d’essai sont en réalité des complexes d’espèces cryptiques.
Un bon exemple est le ver de compost Eisenia fetida/andrei (utilisé dans l’ISO 11268-1, l’ISO 11268-2 et
l’ISO 17512-1), pour lequel les caractéristiques morphologiques seules peuvent ne pas être suffisantes
[5][36]
pour distinguer les deux espèces . Un autre cas connu est l’acarien prédateur, Hypoaspis (Geolaelaps)
[50]
aculeifer , qu’il est possible de confondre avec H. miles, couramment utilisé dans la lutte biologique
[31]
contre les parasites .
Les erreurs d’identification des espèces, l’utilisation d’une morpho-espèce qui est en réalité un complexe
d’espèces cryptiques, ou encore le mélange d’espèces dans des cultures de laboratoire, peuvent être très
problématiques pour la fiabilité des essais écotoxicologiques. Dans un complexe de morpho-espèces, les
espèces jumelles peuvent présenter des différences écologiques, comportementales et physiologiques
et peuvent également réagir différemment aux substances toxiques (par exemple, Références [2], [17],
[35], [40]). Il semblerait que cela soit également le cas du collembole Folsomia candida (utilisé dans
l’ISO 11267 et l’ISO 17512-2), dans lequel des niveaux de différenciation génétique ont été observés
[9],[19],[41]
parmi les populations naturelles de F. candida et parmi les souches de laboratoire . Même si
différentes souches de laboratoire se sont avérées présenter uniquement des différences mineures en
[12],[9]
termes de sensibilité à certains produits chimiques , d’autres études ont détecté une variation
importante du comportement d’évitement du phenmedipham et des réactions d’adaptation divergentes
[14][30]
à l’exposition au cadmium parmi les souches génétiquement différenciées . De plus, même si deux
espèces présentent des réponses similaires aux substances toxiques, la présence de deux espèces dans
la même culture de laboratoire peut entraîner la production d’hybrides stériles, c
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.