ISO 20633:2015
(Main)Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography
Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography
ISO 20633:2015 specifies a method for the simultaneous quantitative determination of vitamin E (α-tocopherol and α-tocopheryl acetate) and vitamin A (13-cis and all-trans isomers of retinyl palmitate and retinyl acetate) present in all forms of infant and adult formulas (powders, ready-to-feed liquids and liquid concentrates). Retinol is not used for fortification purposes and therefore is not addressed in this method. The innate amount in products is insignificant. Stereoisomers of vitamin E, α-tocopherol and α-tocopheryl acetate, are not differentiated in this method.
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur en vitamine E et de la teneur en vitamine A par chromatographie liquide à haute performance en phase normale
ISO 20633:2015 spécifie une méthode de dosage simultané de la vitamine E (α‑tocophérol et acétate d'α-tocophéryle) et de la vitamine A (isomères 13-cis et tout-trans du palmitate de rétinyle et de l'acétate de rétinyle) présentes dans toutes les formes de formules infantiles et pour adultes (poudres, liquides prêts à servir et liquides concentrés). Le rétinol n'est pas utilisé à des fins d'enrichissement et n'est donc pas abordé dans cette méthode. Sa quantité présente naturellement dans les produits n'est pas significative. Les stéréoisomères de la vitamine E, α-tocophérol et acétate d'α-tocophéryle, ne sont pas différenciés dans la présente méthode.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20633
First edition
2015-11-01
Infant formula and adult
nutritionals — Determination of
vitamin E and vitamin A by normal
phase high performance liquid
chromatography
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en vitamine E et de la teneur en vitamine A
par chromatographie liquide à haute performance en phase normale
Reference number
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ISO 2015
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Terms and definitions . 1
3 Principle . 1
4 Reagents and materials . 2
5 Apparatus . 6
6 Procedure. 7
6.1 Sample preparation . 7
6.1.1 General. 7
6.1.2 Dry blended powder samples . 7
6.1.3 Wet blended powder samples . 7
6.1.4 Liquid samples . 7
6.1.5 Sample extraction . 7
6.2 HPLC analysis . 7
6.2.1 General. 7
6.2.2 Detector settings . 8
6.2.3 Pump gradient elution cycle . 8
7 System suitability. 8
8 Calculations. 8
Annex A (informative) Examples of chromatograms .10
Annex B (informative) Precision data .16
Annex C (informative) Comparison between AOAC 2012.10, EN 12822 and EN 12823-1 .19
Bibliography .23
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products in collaboration with
AOAC INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The
method described in this International Standard is equivalent to the AOAC Official Method 2012-10:
Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high
performance liquid chromatography.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20633:2015(E)
Infant formula and adult nutritionals — Determination
of vitamin E and vitamin A by normal phase high
performance liquid chromatography
WARNING — The use of this International Standard can involve hazardous materials, operations
and equipment. This International Standard does not purport to address all the safety problems
associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to
establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of regulatory
limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the simultaneous quantitative determination of
vitamin E (α-tocopherol and α-tocopheryl acetate) and vitamin A (13-cis and all-trans isomers of retinyl
palmitate and retinyl acetate) present in all forms of infant and adult formulas (powders, ready-to-feed
liquids and liquid concentrates).
Retinol is not used for fortification purposes and therefore is not addressed in this method. The innate
amount in products is insignificant.
Stereoisomers of vitamin E, α-tocopherol and α-tocopheryl acetate, are not differentiated in this method.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
adult nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the
sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,
starch and amino acids, with and without intact protein
2.2
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of
infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3 Principle
This procedure utilizes the proteolytic enzyme, papain, to hydrolyze the hydrophilic protein coating of
fat micelles in milk or soy-based infant formulations in an aqueous solution. The hydrophobic contents
of the micelles are then extracted quantitatively into iso-octane in a single extraction. The extract is
analysed by normal phase HPLC using an analytical column with gradient elution. Quantification
of α-tocopherol and α-tocopheryl acetate is done using fluorescence detection with excitation and
emission wavelengths at 280 nm and 310 nm. Retinyl palmitate (cis and trans) and retinyl acetate (cis
and trans) are quantified using UV detection at 325 nm.
4 Reagents and materials
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
4.1 Methyl-t-butyl ether, also known as tert-butylmethylether, HPLC grade.
4.2 n-Hexane, HPLC grade.
4.3 Ethanol, HPLC grade.
4.4 Methanol, HPLC grade.
4.5 Iso-octane (2,2,4-trimethylpentane), HPLC grade.
1)
4.6 Papain (from Carica papaya), ≥ 3 U/mg, Sigma 76220 or equivalent.
1)
4.7 Hydroquinone, Sigma H9003 or equivalent.
4.8 Glacial acetic acid, analytical reagent grade.
4.9 Anhydrous sodium acetate.
4.10 Dilute hydrochloric acid solution.
Dilute 100 ml of a hydrochloric acid solution with a mass fraction of 36 % to 200 ml with water.
4.11 Papain solution, mass concentration ρ = 20 g/l.
Dissolve 100 mg hydroquinone and 4 g anhydrous sodium acetate in approximately 80 ml of water in
a 100 ml one-mark volumetric flask (5.11). Adjust the pH to 5,0 with dilute hydrochloric acid solution
(4.10). Add 2 g of papain and make up to volume. Prepare fresh prior to use.
4.12 Acidified methanol solution.
Add 20 ml of glacial acetic acid to 1 l of methanol and mix. Prepare fresh on the day of use.
4.13 HPLC mobile phase A.
n-Hexane, filtered and degassed for 15 min in an ultrasonic bath.
4.14 HPLC mobile phase B.
Mix 750 ml of n-hexane with 250 ml of methyl-t-butyl ether. Add 3 ml of methanol, filter and degas for
15 min in an ultrasonic bath.
4.15 Standard substances
4.15.1 Retinyl palmitate reference standard, primary reference standard. The standard shall contain
antioxidant. CAS 78-81-2.
1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2015 – All rights reserved
4.15.2 Retinyl acetate reference standard, primary reference standard. CAS 127-47-9.
4.15.3 α-tocopheryl acetate reference standard, primary reference standard. CAS 7695-91-2
4.15.4 α-tocopherol reference standard, primary reference standard. CAS 10191-41-0.
4.16 Standard solutions
4.16.1 Retinyl palmitate stock standard solution.
Weigh to the nearest 0,01 mg, approximately 70 mg of retinyl palmitate (4.15.1) into a 50 ml volumetric
flask (5.11). Dissolve in and dilute to volume with iso-octane (4.5).
4.16.2 Retinyl acetate stock standard solution.
Weigh, to the nearest 0,01 mg, approximately 35 mg of retinyl acetate (4.15.2) into a 50 ml volumetric
flask (5.11). Dissolve in and dilute to volume with ethanol (4.3).
4.16.3 α-tocopheryl acetate stock standard solution.
Weigh, to the nearest 0,01 mg, approximately 180 mg of α-tocopheryl acetate (4.15.3) into a 50 ml
volumetric flask (5.11). Dissolve in and dilute to volume with iso-octane.
4.16.4 α-tocopherol stock standard solution.
Weigh, to the nearest 0,01 mg, approximately 100 mg of α-tocopherol (4.15.4) into a 50 ml volumetric
flask (5.11). Dissolve in and dilute to volume with iso-octane.
NOTE The above stock standard solutions are stable in a refrigerator at 4 °C to 8 °C for up to 7 days.
4.16.5 Combined working standard solution 1.
Transfer by pipette 4 ml of retinyl palmitate stock standard solution (4.16.1), 4 ml of retinyl acetate
stock standard solution (4.16.2), 7 ml of α-tocopheryl acetate stock standard solution (4.16.3) and
20 ml of α-tocopherol stock standard solution (4.16.4), into a 50 ml volumetric flask (5.11) and dilute to
volume with iso-octane. Prepare this solution freshly prior to use.
4.16.6 Combined working standard solution 2.
Transfer by pipette 8 ml of combined working standard solution 1 (4.16.5) into a 100 ml volumetric
flask (5.11) and dilute to volume with iso-octane. Prepare this solution freshly prior to use.
4.16.7 Calibration standard solutions
Into separate 50 ml volumetric flasks (5.11), transfer by pipette 0,5 ml, 2 ml, 4 m
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20633
Première édition
2015-11-01
Formules infantiles et produits
nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en
vitamine E et de la teneur en vitamine
A par chromatographie liquide à haute
performance en phase normale
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid
chromatography
Numéro de référence
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ISO 2015
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Termes et définitions . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs et matériaux . 2
5 Appareillage . 6
6 Mode opératoire. 7
6.1 Préparation de l’échantillon . 7
6.1.1 Généralités . 7
6.1.2 Échantillons de poudre mélangés à sec . 7
6.1.3 Échantillons de poudre issus d’un mélange par voie humide . 7
6.1.4 Échantillons liquides . 7
6.1.5 Extraction des échantillons . 8
6.2 Analyse par CLHP . 8
6.2.1 Généralités . 8
6.2.2 Paramètres du détecteur . 8
6.2.3 Cycle d’élution à gradient de la pompe . 8
7 Adéquation du système . 9
8 Calculs . 9
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .11
Annexe B (informative) Données de fidélité .17
Annexe C (informative) Comparaison entre l’AOAC 2012.10, l’EN 12822 et l’EN 12823-1 .21
Bibliographie .25
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, en
collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Le document est publié par l’ISO et séparément par
l’AOAC INTERNATIONAL. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est équivalente
à la Méthode officielle de l’AOAC 2012-10: Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en vitamine E et de la teneur en vitamine A par chromatographie liquide à haute
performance en phase normale.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20633:2015(F)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en vitamine E et de
la teneur en vitamine A par chromatographie liquide à
haute performance en phase normale
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des
matériaux, des opérations et des équipements dangereux. La présente Norme internationale
n’a pas pour but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Avant d’utiliser
la présente Norme internationale, il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées
de sécurité et de protection de la santé et de déterminer l’applicabilité des restrictions
réglementaires.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de dosage simultané de la vitamine E
(α-tocophérol et acétate d’α-tocophéryle) et de la vitamine A (isomères 13-cis et tout-trans du palmitate
de rétinyle et de l’acétate de rétinyle) présentes dans toutes les formes de formules infantiles et pour
adultes (poudres, liquides prêts à servir et liquides concentrés).
Le rétinol n’est pas utilisé à des fins d’enrichissement et n’est donc pas abordé dans cette méthode. Sa
quantité présente naturellement dans les produits n’est pas significative.
Les stéréoisomères de la vitamine E, α-tocophérol et acétate d’α-tocophéryle, ne sont pas différenciés
dans la présente méthode.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
produit nutritionnel pour adultes
aliment complet sur le plan nutritionnel, spécialement formulé, consommé sous forme liquide, pouvant
constituer la seule source d’alimentation, constitué de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,
lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte
2.2
formule infantile
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3 Principe
Ce mode opératoire utilise l’enzyme protéolytique papaïne pour hydrolyser le revêtement protéique
hydrophile des micelles de matière grasse dans le lait ou les formules infantiles à base de soja en solution
aqueuse. Le contenu hydrophobe des micelles est ensuite extrait quantitativement dans l’iso-octane,
en une seule extraction. L’extrait est analysé par CLHP en phase normale en utilisant une colonne
analytique avec élution en gradient. La quantification de l’α-tocophérol et l’acétate d’α-tocophéryle est
effectuée en utilisant la détection en fluorescence, avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission
de 280 nm et de 310 nm. Le palmitate de rétinyle (cis et trans) et l’acétate de rétinyle (cis et trans) sont
quantifiés par détection dans l’UV à 325 nm.
4 Réactifs et matériaux
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.
4.1 Éther de méthyl-t-butyle, également désigné par tert-butylméthyléther, qualité CLHP.
4.2 n-Hexane, qualité CLHP.
4.3 Éthanol, qualité CLHP.
4.4 Méthanol, qualité CLHP.
4.5 Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane), qualité CLHP.
1)
4.6 Papaïne (de Carica papaya), ≥ 3 U/mg, Sigma 76220 ou l’équivalent.
1)
4.7 Hydroquinone, Sigma H9003 ou l’équivalent.
4.8 Acide acétique glacial, qualité réactif analytique.
4.9 Acétate de sodium anhydre.
4.10 Solution diluée d’acide chlorhydrique.
Diluer 100 ml de solution d’acide chlorhydrique de fraction massique 36 % à 200 ml avec de l’eau.
4.11 Solution de papaïne, concentration massique ρ = 20 g/l.
Dissoudre 100 mg d’hydroquinone et 4 g d’acétate de sodium anhydre dans environ 80 ml d’eau dans une
fiole jaugée de 100 ml à un trait (5.11). Ajuster le pH à 5,0 avec une solution diluée d’acide chlorhydrique
(4.10). Ajouter 2 g de papaïne et compléter au volume. Préparer une solution fraîche avant utilisation.
4.12 Solution de méthanol acidifiée.
Ajouter 20 ml d’acide acétique glacial à 1 l de méthanol et mélanger. Préparer une solution fraîche le
jour de l’utilisation.
4.13 Phase mobile de CLHP A.
n-Hexane, filtré et dégazé pendant 15 min dans un bain à ultrasons.
4.14 Phase mobile de CLHP B.
Mélanger 750 ml de n-hexane avec 250 ml d’éther méthyl-t-butylique. Ajouter 3 ml de méthanol, filtrer
et dégazer pendant 15 min dans un bain à ultrasons.
1) Ceci est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés
4.15 Substances étalons
4.15.1 Étalon de référence de palmitate de rétinyle, étalon de référence primaire. L’étalon doit
contenir un antioxydant. CAS 78-81-2.
4.15.2 Étalon de référence d’acétate de rétinyle, étalon de référence primaire. CAS 127-47-9.
4.15.3 Étalon de référence d’acétate d’α-tocophéryle, étalon de référence primaire. CAS 7695-91-2.
4.15.4 Étalon de référence d’α-tocophérol, étalon de référence primaire. CAS 10191-41-0.
4.16 Solutions étalons
4.16.1 Solution étalon mère de palmitate de rétinyle.
Peser, à 0,01 mg près, environ 70 mg de palmitate de rétinyle (4.15.1) dans une fiole jaugée de 50 ml
(5.11). Dissoudre et diluer au volume avec de l’iso-octane (4.5).
4.16.2 Solution étalon mère d’acétate de rétinyle.
Peser, à 0,01 mg près, environ 35 mg d’acétate de rétinyle (4.15.2) dans une fiole jaugée de 50 ml (5.11).
Dissoudre et diluer au volume avec de l’éthanol (4.3).
4.16.3 Solution étalon mère d’acétate d’α-tocophéryle.
Peser, à 0,01 mg près, environ 180 mg d’acétate d’α-tocophéryle (4.15.3) dans une fiole jaugée de 50 ml
(5.11). Dissoudre et diluer au volume avec de l’iso-octane.
4.16.4 Solution étalon mère d’α-tocophérol.
Peser, à 0,01 mg près
...
Questions, Comments and Discussion
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