ISO 10993-5:2009
(Main)Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
ISO 10993-5:2009 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices. These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device either directly or through diffusion. These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using appropriate biological parameters.
Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
L'ISO 10993-5:2009 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des dispositifs médicaux. Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de dispositif, soit directement, soit par diffusion. Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de paramètres biologiques adaptés.
General Information
Relations
Related Packages
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10993-5
Third edition
2009-06-01
Biological evaluation of medical
devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Reference number
©
ISO 2009
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2009
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2009 – All rights reserved
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Sample and control preparation. 2
4.1 General. 2
4.2 Preparation of liquid extracts of material. 3
4.3 Preparation of material for direct-contact tests .4
4.4 Preparation of controls . 5
5 Cell lines . 5
6 Culture medium. 5
7 Preparation of cell stock culture. 6
8 Test procedures . 6
8.1 Number of replicates . 6
8.2 Test on extracts . 6
8.3 Test by direct contact. 7
8.4 Test by indirect contact. 7
8.5 Determination of cytotoxicity . 9
9 Test report . 10
10 Assessment of results. 11
Annex A (informative) Neutral red uptake (NRU) cytotoxicity test. 12
Annex B (informative) Colony formation cytotoxicity test. 19
Annex C (informative) MTT cytotoxicity test . 24
Annex D (informative) XTT cytotoxicity test. 29
Bibliography . 34
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10993-5 was prepared by Technical Committee ISO/TC 194, Biological evaluation of medical devices.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 10993-5:1999) which has been technically
revised.
ISO 10993 consists of the following parts, under the general title Biological evaluation of medical devices:
⎯ Part 1: Evaluation and testing within a risk management process
⎯ Part 2: Animal welfare requirements
⎯ Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity
⎯ Part 4: Selection of tests for interactions with blood
⎯ Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
⎯ Part 6: Tests for local effects after implantation
⎯ Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals
⎯ Part 9: Framework for identification and quantification of potential degradation products
⎯ Part 10: Tests for irritation and skin sensitization
⎯ Part 11: Tests for systemic toxicity
⎯ Part 12: Sample preparation and reference materials
⎯ Part 13: Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices
⎯ Part 14: Identification and quantification of degradation products from ceramics
⎯ Part 15: Identification and quantification of degradation products from metals and alloys
iv © ISO 2009 – All rights reserved
⎯ Part 16: Toxicokinetic study design for degradation products and leachables
⎯ Part 17: Establishment of allowable limits for leachable substances
⎯ Part 18: Chemical characterization of materials
⎯ Part 19: Physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials [Technical
Specification]
⎯ Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices [Technical Specification]
Introduction
Due to the general applicability of in vitro cytotoxicity tests and their widespread use in evaluating a large
range of devices and materials, it is the purpose of this part of ISO 10993, rather than to specify a single test,
to define a scheme for testing which requires decisions to be made in a series of steps. This should lead to
the selection of the most appropriate test.
Three categories of test are listed: extract test, direct contact test, indirect contact test.
The choice of one or more of these categories depends upon the nature of the sample to be evaluated, the
potential site of use and the nature of the use.
This choice then determines the details of the preparation of the samples to be tested, the preparation of the
cultured cells, and the way in which the cells are exposed to the samples or their extracts.
At the end of the exposure time, the evaluation of the presence and extent of the cytotoxic effect is undertaken.
It is the intention of this part of ISO 10993 to leave open the choice of type of evaluation. Such a strategy
makes available a battery of tests, which reflects the approach of many groups that advocate in vitro biological
tests.
The numerous methods used and endpoints measured in cytotoxicity determination can be grouped into the
following categories of evaluation:
⎯ assessments of cell damage by morphological means;
⎯ measurements of cell damage;
⎯ measurements of cell growth;
⎯ measurements of specific aspects of cellular metabolism.
There are several means of producing results in each of these four categories. The investigator should be
aware of the test categories and into which category a particular technique fits, in order that comparisons be
able to be made with other results on similar devices or materials both at the intra- and interlaboratory level.
Examples of quantitative test protocols are given in annexes. Guidance for the interpretation of the results is
given in this part of ISO 10993.
vi © ISO 2009 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-5:2009(E)
Biological evaluation of medical devices —
Part 5:
Tests for in vitro cytotoxicity
1 Scope
This part of ISO 10993 describes test methods to assess the in vitro cytotoxicity of medical devices.
These methods specify the incubation of cultured cells in contact with a device and/or extracts of a device
either directly or through diffusion.
These methods are designed to determine the biological response of mammalian cells in vitro using
appropriate biological parameters.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management system
ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10993-1 and the following apply.
3.1
culture vessels
vessels appropriate for cell culture including glass petri dishes, plastic culture flasks or plastic multiwells and
microtitre plates
NOTE These can be used interchangeably in these methods provided that they meet the requirements of tissue
culture grade and are suitable for use with mammalian cells.
3.2
positive control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, provides a reproducible cytotoxic
response
NOTE The purpose of the positive control is to demonstrate an appropriate test system response. For example, an
1)
organotin-stabilized polyurethane has been used as positive control for solid materials and extracts. Dilutions of phenol,
for example, have been used as a positive control for extracts. In addition to a material, pure chemicals can also be used
to demonstrate the performance of the test system.
3.3
blank
extraction vehicle not containing the test sample, retained in a vessel identical to that which holds the test
sample and subjected to conditions identical to those to which the test sample is subjected during its
extraction
NOTE The purpose of the blank is to evaluate the possible confounding effects due to the extraction vessel, vehicle
and extraction process.
3.4
negative control material
material which, when tested in accordance with this part of ISO 10993, does not produce a cytotoxic response
NOTE The purpose of the negative control is to demonstrate background response of the cells. For example,
2)
high-density polyethylene for synthetic polymers, and aluminium oxide ceramic rods for dental material have been used
as negative controls.
3.5
test sample
material, device, device portion, component, extract or portion thereof that is subjected to biological or
chemical testing or evaluation
3.6
subconfluency
approximately 80 % confluency, i.e. the end of the logarithmic phase of growth
4 Sample and control preparation
4.1 General
The test shall be performed on
a) an extract of the test sample
and/or
b) the test sample itself.
Sample preparation shall be in accordance with ISO 10993-12.
Negative and positive controls shall be included in each assay.
1) The ZDEC and ZDBC polyurethanes are available from the Food and Drug Safety Center, Hatano Research Institute,
Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257,
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10993-5
Troisième édition
2009-06-01
Évaluation biologique des dispositifs
médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
Biological evaluation of medical devices —
Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
Numéro de référence
©
ISO 2009
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2009
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2009 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . vi
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Préparation des échantillons et des contrôles. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préparation des extraits liquides de matériau.3
4.3 Préparation du matériau pour les essais en contact direct . 4
4.4 Préparation des contrôles . 5
5 Lignées cellulaires. 5
6 Milieu de culture. 6
7 Préparation de la culture cellulaire mère . 6
8 Modes opératoires d'essai. 6
8.1 Nombre d'exemplaires . 6
8.2 Essais à partir d'extraits . 6
8.3 Essai par contact direct . 7
8.4 Essai par contact indirect . 8
8.5 Détermination de la cytotoxicité . 9
9 Rapport d'essai . 11
10 Interprétation des résultats . 11
Annexe A (informative) Essai de cytotoxicité par fixation du rouge neutre (NRU) . 12
Annexe B (informative) Essai de cytotoxicité par formation de colonies . 19
Annexe C (informative) Essai de cytotoxicité au MTT. 24
Annexe D (informative) Essai de cytotoxicité au XTT . 29
Bibliographie . 34
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10993-5 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 194, Évaluation biologique des dispositifs
médicaux.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 10993-5:1999), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
L'ISO 10993 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Évaluation biologique des
dispositifs médicaux:
⎯ Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un processus de gestion du risque
⎯ Partie 2: Exigences relatives à la protection des animaux
⎯ Partie 3: Essais concernant la génotoxicité, la cancérogénicité et la toxicité sur la reproduction
⎯ Partie 4: Choix des essais pour les interactions avec le sang
⎯ Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité in vitro
⎯ Partie 6: Essais concernant les effets locaux après implantation
⎯ Partie 7: Résidus de stérilisation à l'oxyde d'éthylène
⎯ Partie 9: Cadre pour l'identification et la quantification des produits potentiels de dégradation
⎯ Partie 10: Essais d'irritation et de sensibilisation cutanée
⎯ Partie 11: Essais de toxicité systémique
⎯ Partie 12: Préparation des échantillons et matériaux de référence
⎯ Partie 13: Identification et quantification de produits de dégradation de dispositifs médicaux à base de
polymères
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés
⎯ Partie 14: Identification et quantification des produits de dégradation des céramiques
⎯ Partie 15: Identification et quantification des produits de dégradation issus des métaux et alliages
⎯ Partie 16: Conception des études toxicocinétiques des produits de dégradation et des substances
relargables
⎯ Partie 17: Établissement des limites admissibles des substances relargables
⎯ Partie 18: Caractérisation chimique des matériaux
⎯ Partie 19: Caractérisations physicochimique, morphologique et topographique des matériaux
[Spécification technique]
⎯ Partie 20: Principes et méthodes relatifs aux essais d'immunotoxicologie des dispositifs médicaux
[Spécification technique]
Introduction
En raison de l'applicabilité générale des essais de cytotoxicité in vitro et de leur utilisation courante pour
l'évaluation de toute une variété de dispositifs et matériaux, l'objet de la présente partie de l'ISO 10993 est de
définir un schéma des essais qui nécessite la prise de décisions concernant une série de phases, plutôt que
de spécifier un essai unique. Cette démarche doit mener à la sélection de l'essai le plus approprié.
Trois catégories d'essais sont répertoriées: essai d'extrait, essai par contact direct, essai par contact indirect.
Le choix d'une ou de plusieurs de ces catégories dépend de la nature de l'échantillon à évaluer, du site
d'utilisation potentiel et de la nature de l'utilisation.
Ce choix détermine alors les détails de la préparation des échantillons à soumettre à essai, de la préparation
des cellules cultivées et la façon dont les cellules sont exposées aux échantillons ou à leurs extraits.
L'évaluation de la présence et de la mesure de l'effet cytotoxique est entreprise à la fin de la durée
d'exposition. L'intention de la présente partie de l'ISO 10993 est de laisser ouvert le choix du type d'évaluation.
Une telle stratégie laisse à disposition toute une batterie d'essais et reflète l'approche de nombreux groupes
qui recommandent des essais biologiques in vitro.
Les nombreuses méthodes employées et les points finaux mesurés lors de la détermination de cytotoxicité
peuvent être regroupés selon les différentes catégories d'évaluation suivantes:
⎯ évaluation des dommages cellulaires par des observations morphologiques;
⎯ mesurages des dommages cellulaires;
⎯ mesurages de la croissance cellulaire;
⎯ mesurages d'aspects particuliers du métabolisme cellulaire.
Il existe plusieurs moyens d'obtenir des résultats dans chacune de ces quatre catégories. Afin que des
comparaisons avec d'autres résultats intra- et interlaboratoires sur des dispositifs ou matériaux similaires
puissent être faites, il est préférable que l'investigateur connaisse les catégories d'essai à laquelle chaque
technique particulière appartient. Des exemples de protocoles d'essai quantitatif sont donnés dans les
annexes. Les directives d'interprétation des résultats sont données dans la présente partie de l'ISO 10993.
vi © ISO 2009 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 10993-5:2009(F)
Évaluation biologique des dispositifs médicaux —
Partie 5:
Essais concernant la cytotoxicité in vitro
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 10993 spécifie les méthodes d'essai d'évaluation de la cytotoxicité in vitro des
dispositifs médicaux.
Ces méthodes décrivent l'incubation des cellules cultivées en contact avec un dispositif et/ou des extraits de
dispositif, soit directement, soit par diffusion.
Elles sont conçues pour déterminer la réponse biologique in vitro des cellules de mammifère au moyen de
paramètres biologiques adaptés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10993-1, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un
système de gestion du risque
ISO 10993-12, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 10993-1, ainsi que les
suivants s'appliquent.
3.1
récipients de culture
récipients adaptés à la culture cellulaire tels que les boîtes de Petri en verre, les flacons de culture en
plastique ou les plaques multipuits et les plaques de microtitration en plastique
NOTE Dans ces méthodes, ces récipients de culture peuvent être utilisés de manière interchangeable tant qu'ils
satisfont aux exigences de classe de culture tissulaire et conviennent à la culture cellulaire de mammifère.
3.2
matériau de contrôle positif
matériau qui, soumis à essai conformément à la présente partie de l'ISO 10993, induit une réponse
cytotoxique reproductible
NOTE L'objet du contrôle positif est de mettre en évidence une réponse adaptée à l'essai choisi. Par exemple, des
1)
polyuréthanes stabilisés à l'étain ont servi de contrôles positifs pour les matériaux solides et les extraits. Des dilutions de
phénol, par exemple, ont servi de contrôle positif pour les extraits. En plus des matériaux, des produits chimiques purs
peuvent aussi être utilisés pour démontrer la performance du système d'essai.
3.3
blanc
véhicule d'extraction ne contenant pas l'échantillon d'essai, contenu dans un récipient identique à celui
renfermant l'échantillon d'essai et soumis à des conditions identiques à ce dernier au cours de son extraction
NOTE L'objet du blanc est d'évaluer les effets trompeurs provoqués par le récipient d'extraction, le vé
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.