ISO 20976-1:2019
(Main)Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and maximum growth rate
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and maximum growth rate
This document specifies protocols for conducting microbiological challenge tests for growth studies on vegetative and spore-forming bacteria in raw materials and intermediate or end products. The use of this document can be extended to yeasts that do not form mycelium.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologique — Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de croissance maximal
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests de croissance sur les bactéries végétatives et sporulées dans les matières premières, les produits intermédiaires ou produits finis. L'utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20976-1
First edition
2019-03
Microbiology of the food chain —
Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and
feed products —
Part 1:
Challenge tests to study growth
potential, lag time and maximum
growth rate
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologique —
Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le
temps de latence et le taux de croissance maximal
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
4.1 General . 4
4.2 Estimation of the growth potential . 6
4.3 Estimation of the growth kinetics parameters (lag time and maximum growth rate) . 7
5 Apparatus . 7
6 Culture media and reagents . 7
7 Study design and sampling . 8
7.1 General . 8
7.2 Setting decision criteria for growth potential . 8
7.3 Number of batches and selection criteria . 8
7.4 Preparation of the test units . 8
7.5 Number of test units to be inoculated. 9
8 Selection of strains . 9
9 Preparation of the inoculum .10
9.1 General .10
9.2 Preparation of the vegetative cell suspensions .10
9.3 Preparation of the spore suspensions .10
10 Inoculation of the tests units .10
11 Controls .11
11.1 Food controls .11
11.2 Control units.11
12 Storage of the test units .12
12.1 General .12
12.2 Estimation of growth potential .12
12.3 Estimation of growth kinetics parameters (lag time and growth rate) .12
13 Analysis .12
14 Expression of the results .13
14.1 General .13
14.2 Growth potential (Δ) .13
14.3 Growth kinetics parameters (lag time and growth rate) .14
15 Test report .14
15.1 General .14
15.2 Aim of the study and type of challenge test .14
15.3 Experimental protocol .15
15.4 Sample analysis .15
15.5 Results .15
15.6 Conclusions .16
15.7 Reference documents .16
Annex A (informative) Inter-batch variability assessment based on pH and a .17
w
Annex B (normative) Minimum number of units to prepare for the challenge test study .18
Annex C (informative) Examples of protocols to prepare inocula .19
Annex D (informative) Examples of how to estimate growth potential, lag time and
maximum growth rate from results of challenge tests .22
Annex E (informative) Use of simulation to assess a microbial population under different
temperature conditions .26
Bibliography .27
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
A list of all the parts in the ISO 20976 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
Introduction
Under the general principles of the Codex Alimentarius on food hygiene, it is the responsibility of food
business operators (FBOs) to control microbiological hazards in foods and to manage microbial risks.
[11]
Therefore, FBOs implement validated control measures within the hazard analysis and critical
control point (HACCP) system, and conduct studies in order to investigate compliance with the food
safety criteria throughout the food chain.
In the framework of microbial risk assessment (MRA), several complementary approaches are developed
to estimate risks posed by pathogens or spoilage microorganisms in the food chain. MRA is adopted by
regulators under the auspices of the international agency for setting food standards. Challenge testing
is one of the recognized approaches used to validate control measures within the HACCP system, as
well as to assess microbiological safety and quality of food, food production processes, food storage
conditions and food preparation recommendations for consumers.
This document provides technical rules, calculations and approaches to investigate the ability of
inoculated microorganism(s) of concern to grow, survive or be inactivated in raw materials and
intermediate or end products under reasonably foreseeable food processes, storage and use conditions.
The objective and the scope of the document are to determine the experimental design and the selection
of the study conditions. Regulatory authorities can have different recommendations, and these
differences have been included as much as possible. It is, however, possible that specific requirements
should be incorporated to get regulatory approval of the challenge test.
As growth and inactivation kinetics are clearly different, the ISO 20976 series consists of two parts,
under the general title, Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting
challenge tests of food and feed products:
— Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and maximum growth rate
— Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetics parameters (to be developed)
The use of the ISO 20976 series involves expertise in relevant areas, such as food microbiology, food
science, food processing and statistics. The statistical expertise encompasses an understanding of
sampling theory and design of experiments, statistical analysis of microbiological data and overview
of scientifically recognized and available mathematical concepts used in predictive modelling. Even
though many mathematical models are available to describe and predict bacterial growth, the gamma-
[22]
concept (γ-concept) is particularly useful for further simulations using the data generated from
the challenge test, e.g. to assess the growth at storage temperatures other than the one(s) tested, or in
helping to design better food formulations and storage conditions, and thus improving the microbial
quality and/or safety of the food under consideration.
For practical reasons, the term “food” includes feed.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20976-1:2019(E)
Microbiology of the food chain — Requirements and
guidelines for conducting challenge tests of food and feed
products —
Part 1:
Challenge tests to study growth potential, lag time and
maximum growth rate
1 Scope
This document specifies protocols for conducting microbiological challenge tests for growth studies on
vegetative and spore-forming bacteria in raw materials and intermediate or end products.
The use of this document can be extended to yeasts that do not form mycelium.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 18787:2017, Foodstuffs — Determination of water activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
bacterial spore
resistant form of bacteria that is dormant until the germination (3.9) step
3.2
batch
group or set of identifiable food obtained through a given process under practically identical
circumstances and produced in a given place within one defined production period
Note 1 to entry: The batch is determined by parameters established beforehand by the organization and may be
described by other terms, e.g. lot.
[SOURCE: Commission Regulation (EC) No 2073/2005]
3.3
cardinal value
estimated minimal, optimal and maximal values of physico-chemical factors (e.g. temperature, pH, a )
w
that characterize the growth of a given microbial strain
3.4
control unit
unit of food identical to the test unit (3.24) but not artificially contaminated (used as a blank)
3.5
challenge test
study of the growth or inactivation of microorganism(s) artificially inoculated in food
3.6
experimental datapoint
result of analysis of a test unit (3.24) per unit weight (log cfu/g), per unit volume (log cfu/ml), or per
10 10
unit area (log cfu/cm )
Note 1 to entry: For specific cases, the enumeration results may be expressed in log MPN.
3.7
exponential growth phase
phase in which the microbial population is exponentially multiplying as rapidly as possible; growth is
dependent on the growth medium and environment (temperature, humidity, etc.)
Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.
3.8
generation time
Tg
time it takes for the microorganisms to increase by a factor 2, also known as doubling time
3.9
germination
mechanism in which a bacterial spore (3.1) starts becoming a vegetative cell (3.25)
3.10
growth potential
Δ
difference between the decimal logarithm of the highest concentration of the target microbial population
(log ) and the decimal logarithm of the initial concentration of this microbial population (log )
max i
Note 1 to entry: The log and log refer to concentrations and are expressed in log cfu/g or log cfu/ml or
max i 10 10
log cfu/cm
3.11
maximum growth rate
kinetics parameter to characterize the exponential growth phase (3.7), represented by the slope of
the curve showing the evolution of the natural logarithm (μ ) or decimal logarithm (V ) of the
max max
population as a function of time, under constant growth conditions
3.12
inoculum
microbial suspension at the desired concentration used to contaminate test units (3.24)
3.13
lag phase
phase, directly after inoculation, during which the microbial population is adapting to the environment,
before it enters the exponential growth phase (3.7)
Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.
2 © ISO 2019 – All rights reserved
3.14
lag time
λ
kinetics parameter in time unit to characterize the lag phase (3.13)
3.15
pH value
measure of the concentration of acidity or alkalinity of a material in an aqueous solution
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modified — Notes 1 and 2 to entry have been removed.]
3.16
primary model
mathematical model describing the changes of microbial counts as a function of time
3.17
organizing laboratory
laboratory with responsibility for managing the challenge tests (3.5)
3.18
sampling
selection of one or more units or portions of food such that the units or portions selected are
representative of that food
3.19
sampling point
time at which the test units (3.24) are analysed and which are represented as experimental datapoints
(3.6) on the kinetics graph
3.20
secondary model
mathematical model describing the effects of the environmental factors (e.g. temperature, pH, a ) on
w
the parameters of the primary model (3.16) (e.g. growth rate)
3.21
sporulation
mechanism by which vegetative cell (3.25) forms spore
3.22
stationary phase
phase in which the microbial population is at its maximum level
Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.
3.23
test portion
measured (volume or mass) representative sample taken from the test unit (3.24) for use in the analysis
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modified — The end of the definition has been changed from “taken
from the laboratory sample for use in the preparation of the initial suspension” and the Note 1 to entry
has been removed.]
3.24
test unit
measured (volume or mass) amount of the food used for inoculation
3.25
vegetative cell
state of microbial form that is capable of growing under favourable environmental conditions
3.26
water activity
a
w
ratio of the water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour pressure of pure water at the same
temperature
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modified — The definition has been condensed and the formula and
Notes 1 and 2 to entry have been removed.]
4 Principle
4.1 General
The aim of the study shall be clearly defined (e.g. assessment/validation of the food shelf-life as a control
measure, assessment of microbial stability). The experimental design shall be in accordance with that
purpose and shall take into account the steps of the food chain for which microbial growth is assessed.
The decision criteria shall be clearly defined (see 7.2).
Knowledge from the FBO on its products (e.g. characteristics or production process) shall be combined
with expertise in food microbiology and analytical sciences to ensure the robustness of the study. The
organizing laboratory shall have knowledge and skills in food microbiology, food science and technology,
and statistics to design and conduct the studies, interpret the results and draw the conclusions. The
analyses shall be conducted under a quality assurance system (e.g. in accordance with ISO/IEC 17025).
Challenge tests aim at studying the growth potential or growth kinetics (lag time and maximum
growth rate) in order to assess, for example, the food shelf-life as a control measure or the microbial
stability of a food.
Growth potential studies are most appropriate to:
— validate the microbiological shelf-life of a food under reasonably foreseeable conditions of use and
storage between production and consumption, ensuring relevant microbiological criteria are met
throughout the product shelf-life;
— assess if a product, tested under specific conditions, supports the growth of the inoculated
microorganism.
Such challenge tests will only validate the specific food characteristics and conditions applied for the
study. When microbiological criteria are not fulfilled or conditions (e.g. food formulation, physico-
chemical characteristics, type and/or concentration of preservatives added, packaging, storage
temperature) are changed, a new growth potential study needs to be carried out in order to validate
the new conditions.
Growth kinetics studies are most appropriate for:
— assessing the effect(s) of intrinsic (e.g. pH, a , preservatives) and extrinsic characteristics (e.g.
w
gas composition, temperature) that have a significant impact on the behaviour of the target
microorganism;
— providing data for developed models to simulate the effect of such factors on microbial behaviour in
the studied food under reasonably foreseeable storage conditions (time and temperature);
— comparing the simulation results to ensure that relevant microbiological criteria are met throughout
the food shelf-life.
Growth kinetics studies are used to estimate and validate the microbiological shelf-life of a food.
They are particularly suitable in the last steps of the food development, including reformulation, new
packaging, and alternative processing conditions.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
A growth kinetics study can be more informative than a growth potential study. However, growth
kinetics studies are more complex in terms of study design, execution, results interpretation and
exploitation, particularly in cases where various factors are included.
The behaviour of a microbial population in a food, i.e. microbial growth kinetics, is dependent on the
characteristics of the food (e.g. a , pH, preservatives concentrations), the food storage conditions
w
(temperature, packaging format and gas composition), the food processes, the physiological state of the
microorganism and interactions with the natural background microorganisms.
Microbial growth kinetics are defined by three major phases (see Figure 1).
a) Lag phase: This phase is characterized by the lag time (λ), which corresponds to the intersection
between the exponential growth phase line (plotted in semi-log coordinates) and the horizontal
[15][18]
line crossing through the initial cell concentration . For spore-forming microorganisms, lag
time includes spore germination and outgrowth.
Lag time is dependent on the food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological),
inoculation levels and storage conditions (e.g. temperature, relative humidity, gas composition).
Lag time is also dependent on the physiological state of the microorganism contaminating the food
and any stress experienced by these cells or spores.
b) Exponential growth phase: This phase is characterized by the growth rate (µ or V ), which
max max
corresponds to the maximum increase in natural or decimal logarithm of cell number per unit of time.
The growth rate corresponds to the slope of the curve showing the evolution of the natural
logarithm (µ ) or decimal logarithm (V ) of the population over time during the exponential
max max
phase. The food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological) and storage conditions
(e.g. temperature, relative humidity, gas composition) can significantly influence microbial growth
rates. The growth rate of a microbial population is unaffected by its initial concentration and
physiological states.
The relationship between the generation time (Tg) and µ is given by Formula (1):
max
μ =ln 2 /Tg (1)
()
max
The slope of the curve plotting the log of the microbial population against time, V , and its
10 max
relationship to maximum growth rate is given by Formula (2):
μ =⋅V ln 10 (2)
()
maxmax
c) Stationary phase: In this phase, the microbial population is at its maximum level.
Key
Y log (cfu/g)
X time (days)
1 lag phase
2 exponential growth phase
3 stationary phase
Figure 1 — Microbial growth kinetics with three major phases
4.2 Estimation of the growth potential
The food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological) and storage conditions (e.g.
temperature, relative humidity, gas composition) can significantly influence the microbial growth
potential.
The inoculum shall be adapted to conditions that mimic the microbial cell or spore injury induced by
food handling/processing or any phenomena that can trigger subsequent adaptive responses to growth
conditions, in order to mimic natural microbial behaviour in the food.
This type of test is designed to estimate the changes in concentration of the microbial population during
the challenge test. These tests can be used to determine whether there is significant microbial growth
in a foodstuff and to quantify the increase in the microbial population under a given set of storage
conditions.
It is important to have a minimum of five sampling points that are evenly distributed across the entire
shelf-life, to get an accurate estimation of the growth potential (see 14.2).
Growth potential does not provide information on the length of the lag phase, growth rate value or
maximum stationary-phase level. This makes the growth potential unsuited for extrapolating the
results to other conditions.
6 © ISO 2019 – All rights reserved
The growth potential can be obtained using dynamic temperature profiles applied to the food during
the study mimicking the food storage conditions.
4.3 Estimation of the growth kinetics parameters (lag time and maximum growth rate)
The growth kinetics characterization consists of the estimation of the lag time and maximum
growth rate. The maximum growth rate is mainly used in assessing, determining and optimizing the
microbiological shelf-life of the food.
Maximum growth rates can be used to directly calculate an increase in microbial counts under the
conditions of the challenge test and/or as inputs for growth simulation.
The experimental design shall generate at least eight experimental data points distributed across all
growth phases, with a minimum of five data points in the exponential phase. Growth kinetics shall
be estimated at a constant temperature by fitting a recognized and commonly accepted mathematical
model used for describing microbial growth.
5 Apparatus
Routine microbiology labware specified in ISO 7218 is required. Specific labware may also be needed to
prepare the test portions, to store them under suitable conditions or monitor how their characteristics
change during the challenge test study. These include the following.
5.1 Apparatus for packaging, the samples under air, under vacuum or under a protective modified
atmosphere.
5.2 Chilled incubator, able to reach and hold setpoint temperatures to ±1 °C.
5.3 Climate-control chamber, able to reach and hold setpoint temperatures to ±1 °C and to adjust
relative humidity to ±10 %.
5.4 pH meter, able to perform measurements to a tolerance of ±0,1 pH units. pH meters shall give
readings to a resolution of 0,01 pH units.
5.5 a meter, meeting the requirements of the ISO 18787.
w
5.6 Headspace gas analyser, to measure gas composition (e.g. O , CO ).
2 2
5.7 Logger for measuring temperature storage conditions of the test unit.
5.8 Logger for measuring relative humidity storage conditions of the test unit.
6 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices as specified in ISO 7218.
For the preparation and performance testing of culture media and reagents, follow the procedures as
specified in ISO 11133 and in the International Standard specific to the microbial population studied. Use
internationally recognized and widely accepted methods or alternative methods validated according
to internationally accepted protocols for the detection or enumeration of target microorganisms (e.g.
ISO 16140-2).
7 Study design and sampling
7.1 General
The study design shall address sources of variability, including:
— the inter-batch variability;
— the intra-batch variability;
— the variability in the artificial inoculation of the test units.
7.2 Setting decision criteria for growth potential
Depending on the aim of the challenge test, decision criteria shall be defined before the start of the
study. A two-step approach is used for growth potential study: one step to determine if growth occurs
and the second to determine how much growth is acceptable.
For example, for Listeria monocytogenes, some institutions consider that a food supports growth when
[10][12]
the growth potential is greater than a cut-off value of 0,5 log , whereas others set this cut-off
[13]
value at 1 log .
7.3 Number of batches and selection criteria
The number of batches to be included in the study depends on the variability of the food production
process and food, especially in regard to the intrinsic (e.g. pH, a , preservatives) and extrinsic (e.g.
w
gas composition) characteristics and microbiological properties of the food. This variability shall be
documented. The characteristics of the studied batches shall be representative of the variability of the
production process based on historical data.
If inter-batch variability of food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological) is
sufficient to induce differences in microbial growth behaviour (when either Δφ or Δψ is over
pHaw
0,2), it is necessary to study different batches in order to evaluate the variability within the microbial
[14]
responses . In that case, a minimum number of three batches should be used for both growth
potential and the growth kinetics studies.
The use of a single batch shall be clearly justified, for example:
a) evaluating the impact of a new formulation of the food;
b) using a batch representing the most favourable growth conditions (worst case);
c) applicable for a growth kinetics study only if the impact of the inter-batch variability determined
by the calculator tool (see Annex A) is not significant.
Annex A provides an appropriate calculation scheme for assessing the impact of the inter-batch
variability of the food, pH and a on the behaviour of the microorganism under test. Annex A is only
w
applicable in cases where the challenge tests are conducted to estimate growth rate and where the pH
and a are the only relevant food characteristics having a significant impact on this kinetics parameter.
w
7.4 Preparation of the test units
Test units representative of the food matrix can be either:
— the complete content of the packaging units,
— aseptically-sampled portions from the packaging unit(s) or from the bulk food.
The tests units shall be maintained at an appropriate storage temperature before inoculation. The test
units shall be inoculated as close as possible to the day of production unless otherwise defined by the
8 © ISO 2019 – All rights reserved
objectives of the study. The test units shall have the same composition as the original food, especially
for composite food.
The test units shall be packed using the same packaging conditions as the original food over the shelf-life
under test. It is recommended to use the same packaging material, comparable gas mix and headspace-
food ratio. If, for example, for practical reasons, it is not possible to use the original food packaging,
or packaging material, the use of alternative packaging material shall be justified. The alternative
packaging material shall have the same technical properties (e.g. gas permeability) as the original.
Prepare the number of units to be used for the inoculation of microorganisms (test units) and for the
control (control units, see Clauses 10 and 11). It is recommended that additional test units are prepared
to cover unforeseen incidents.
7.5 Number of test units to be inoculated
The minimum number of test units to be inoculated for analysis per sampling point will depend on the
inter-batch variability (see Annex B). Depending on the intra-batch variability, the number of test units
and/or sampling point may have to be increased.
The sources of variability in artificial inoculations include the type and structure of the food matrix,
as well as the inoculation procedure. When the three batches are not simultaneously inoculated, the
number of test units to be prepared for Time 0 (t ) should be at least three per batch.
Annex B presents a flowchart for determining the minimum number of test units needed for inoculation,
depending on the expected inter-batch variability, the type of challenge test and the minimum number
of sampling points.
NOTE Microbiological growth can be followed by rapid inactivation (depending on the food composition
and storage conditions). The sampling points are divided over the storage period in order to detect a possible
decrease in levels after initial growth.
See Clause 11 for the number of test units to be prepared for the control tests.
8 Selection of strains
Each strain used shall be characterized biochemically and/or serologically and/or genetically in
sufficient detail for its identity to be known. Strains previously isolated from the food matrix (raw
materials, ingredients, end products) or from the production environment or from clinical/food/
environmental samples in outbreaks involving the food are preferred compared to strains from a
culture type collection. The original source of all isolates should be known and the isolates should be
held in a local (e.g. laboratory that runs the challenge test), national or international culture collection
to enable them to be used in future testing, if required. The growth ability of the strains should have
been determined prior to the challenge tests by historical or published data or by testing them as
described in 9.2 and 9.3.
The selected strain(s) shall be fit for purpose regarding their ability to grow under the tested conditions,
including pH, temperature, a , etc. Whenever possible, use strains for which the cardinal values have
w
been determined (e.g. temperature, pH, a , minimal inhibitory concentration for preservatives) to
w
[22]
enable further predictive modelling using the gamma-concept .
It is recommended that a mix of strains of the same microbial species is used for estimation of growth
potential so that variations among strains are taken into account. To estimate the growth rate, only one
strain shall be used per challenge test.
9 Preparation of the inoculum
9.1 General
Follow current laboratory practices as specified in ISO 7218.
For the preparation and performance testing of culture media and reagents, follow the procedures as
specified in ISO 11133 and in the International Standard specific to the microbial population studied.
9.2 Preparation of the vegetative cell suspensions
Two successive cultures of the selected strain(s) should be conducted as follows.
— First, in a culture medium under conditions that enable optimal growth of the selected strain(s).
The culture should have reached the end of the exponential phase or the early stationary phase, to
standardize the physiological state of the microbial population.
— Second, in a culture medium that mimics the natural conditions of the food under test (at least
temperature and, if relevant, pH and/or a ) in order to adapt the strain(s) and to shorten the lag
w
phase once inoculated in the food (i.e. worst-case scenario). The culture is grown until the end of the
exponential phase or the early stationary phase is reached. Enumeration shall be performed unless
previously determined under the same conditions.
In some cases, the inoculum needs to be submitted to treatments (injury and/or stress) in order to
mimic the food production processes (see C.2). The impact of the induced stress shall be estimated (e.g.
by enumerations on selective and non-selective media before and after the stress treatment).
NOTE There is no need for any adaptation and/or injury treatment if only the maximum growth rate is used
in further simulations.
To avoid adding nutrients when inoculating the test units, serial dilutions of that second culture shall
be performed in non-growth promoting diluent. If relevant, adjust the diluent to the conditions (e.g.
pH, temperature, a ) of the second culture medium in order to maintain the physiological state of the
w
inoculum.
Inoculate the test units immediately.
When using a mix of strains, these strains should be previously individually enumerated and mixed in
equivalent concentrations. The microbial count of the inoculum shall be determined by enumeration
on the same medium that will be used for the challenge test. This count shall be adjusted to fit with the
conditions described in Clause 10.
9.3 Preparation of the spore suspensions
To prepare the spore crop, inoculate the germinated strain(s) into an appropriate culture medium
and incubate under conditions that will promote a high sporulation rate (aerobic/anaerobic, medium,
temperature). The length of this step will vary (from days to weeks) depending on the microbial
species or strain(s) and the sporulation conditions. The extent of sporulation shall be checked with a
microscope prior to harvesting the spores. Spore crops should be enumerated and can be stored until
needed for the challenge test study. An example of a protocol to produce spores is given in C.3.
Prior to conducting the challenge test, enumerate the spore crop on the same medium that will be used
[9]
for the challenge test after an appropriate heat treatment . This concentration shall be adjusted to fit
the conditions described in Clause 10.
10 Inoculation of the tests units
The inoculum procedure aims to achieve the same levels of microorganism per test unit without
modifying the food’s physico-chemical characteristics (pH and a included). To achieve this, it might be
w
10 © ISO 2019 – All rights reserved
necessary to adjust the pH and a of the inoculum. The inoculum volume: sample mass (or volume) ratio
w
should not exceed 1:100.
Before inoculation, food samples shall be equilibrated to the initial temperature of the test.
The inoculation level selected shall be justified for the studied food and microorganisms. To ensure
the accuracy of the results, the level shall fit within the quantification limit of the enumeration method
used. When the initial inoculum concentration is low, the limit of quantification can be lowered, for
example, by increasing the number of the enumeration plates (see Clause 13). An inoculation level
of at least five times the quantification limit of the enumeration method and no more than an initial
concentration of 10 cfu/g (or per unit volume or area) is recommended.
Depending on the food under study, use an inoculation procedure to mimic contamination event(s) to
be studied. For example, at the core (e.g. in a ground food) or at the surface (e.g. by applying several
deposits locally over the surface or by spraying) or by bulk-inoculation (e.g. liquid or semi-liquid food).
The laboratory can identify a part of the heterogeneous food as the most favourable to microbial growth
and inoculate that particular part, but the entire test unit shall be used to determine the concentration
of the target microbial population in the test unit.
Modified atmosphere (including vacuum) packaged food can be opened, inoculated and repacked
according to 7.4. The food can also be contaminated directly by i
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20976-1
Première édition
2019-03
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des
tests d'épreuve microbiologique —
Partie 1:
Tests de croissance pour étudier le
potentiel de croissance, le temps
de latence et le taux de croissance
maximal
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and feed products —
Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and
maximum growth rate
Numéro de référence
©
ISO 2019
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: +41 22 749 09 47
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 4
4.1 Généralités . 4
4.2 Estimation du potentiel de croissance . 6
4.3 Estimation des paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux
de croissance maximal) . 7
5 Appareillage . 7
6 Milieux de culture et réactifs . 8
7 Plan de l’étude et échantillonnage . 8
7.1 Généralités . 8
7.2 Définition des critères de décision concernant le potentiel de croissance . 8
7.3 Nombre de lots et critères de sélection . 8
7.4 Préparation des unités pour essai . 9
7.5 Nombre d’unités pour essai à inoculer . 9
8 Choix des souches . 9
9 Préparation de l’inoculum.10
9.1 Généralités .10
9.2 Préparation des suspensions de cellules végétatives .10
9.3 Préparation des suspensions de spores .11
10 Inoculation des unités pour essai .11
11 Témoins .12
11.1 Aliments témoins .12
11.2 Unités témoins .12
12 Conservation des unités pour essai .12
12.1 Généralités .12
12.2 Estimation du potentiel de croissance .13
12.3 Estimation des paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux
de croissance) .13
13 Analyse .13
14 Expression des résultats.14
14.1 Généralités .14
14.2 Potentiel de croissance (Δ) .14
14.3 Paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux de croissance) .14
15 Rapport d’essai .15
15.1 Généralités .15
15.2 Objectif de l’étude et type de test de croissance .15
15.3 Protocole expérimental .15
15.4 Analyse d’échantillon .16
15.5 Résultats .16
15.6 Conclusions .17
15.7 Documents de référence .17
Annexe A (informative) Évaluation de la variabilité inter-lots prenant en compte le pH et l’a .18
w
Annexe B (normative) Nombre minimum d’unités à préparer pour l’étude du test de croissance .19
Annexe C (informative) Exemples de protocoles de préparation des inocula .20
Annexe D (informative) Exemples de procédures permettant d’estimer le potentiel de
croissance, le temps de latence et le taux de croissance maximal à partir des tests
de croissance .23
Annexe E (informative) Utilisation de la simulation pour évaluer une population
microbienne pour différentes conditions de température .27
Bibliographie .28
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20976 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
Introduction
Selon les principes généraux du Codex Alimentarius sur l’hygiène alimentaire, il est de la responsabilité
des exploitants du secteur alimentaire de maîtriser les dangers microbiologiques dans les aliments
et de gérer les risques microbiens. Par conséquent, l’exploitant du secteur alimentaire doit mettre en
[11]
place des mesures de maîtrise validées, au sein du système HACCP (analyse des dangers et points
critiques pour leur maîtrise), et conduire des études afin d’évaluer la conformité aux critères de sécurité
alimentaire tout au long de la chaîne alimentaire.
Dans le cadre de l’évaluation des risques microbiens, plusieurs approches complémentaires sont
développées afin d’estimer les risques posés par les microorganismes pathogènes ou d’altération
dans la chaîne alimentaire. L’évaluation des risques microbiens est adoptée par les organismes de
réglementation sous les auspices de l’agence internationale chargée des normes alimentaires. Le test
de croissance fait partie des approches reconnues utilisées pour valider les mesures de maîtrise au sein
du système HACCP, ainsi que pour évaluer la sécurité microbiologique et la qualité des aliments, les
procédés de production alimentaire, les conditions de stockage des aliments et les recommandations
relatives à la préparation des aliments pour les consommateurs.
Le présent document fournit les règles techniques, calculs et approches pour l’évaluation de la capacité
des microorganismes inoculés à croître, survivre ou être inactivés dans les matières premières, les
produits intermédiaires ou produits finis pendant toute la durée de conservation des produits soit
dans des conditions de transformation, de distribution, d’entreposage et d’utilisation des aliments
raisonnablement prévisibles. L’objectif et le domaine d’application du document sont la détermination
du plan expérimental et la sélection des conditions de l’étude. Les autorités réglementaires peuvent
avoir des recommandations différentes et ces différences ont été incluses dans la mesure du
possible. Toutefois, il convient parfois d’intégrer des exigences spécifiques pour obtenir l’approbation
réglementaire du test de croissance.
Les cinétiques de croissance et d’inactivation étant clairement différentes, la série ISO 20976 est
constituée de deux parties, sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et
lignes directrices pour la réalisation des tests d’épreuve microbiologique:
— Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de
croissance maximal
— Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de cinétique
(à venir)
L’utilisation de la série ISO 20976 nécessite une expertise dans les secteurs pertinents tels que la
microbiologie des aliments, la science des aliments, la transformation des aliments et les statistiques.
L’expertise statistique englobe la compréhension de la théorie d’échantillonnage et des plans
d’expérience, l’analyse statistique des données microbiologiques et une vue d’ensemble des concepts
mathématiques scientifiquement reconnus et disponibles employés en microbiologie prévisionnelle.
Même si de nombreux modèles mathématiques sont disponibles pour décrire et prévoir la croissance
[22]
bactérienne, le concept gamma (concept γ) est particulièrement utile pour la réalisation de
simulations en utilisant les données générées à partir du test de croissance, par exemple pour évaluer
la croissance à des températures de conservation autres que celles soumises à essai, ou pour aider à
concevoir de meilleures formulations et conditions de conservation des aliments, et ainsi améliorer la
qualité microbienne et/ou la sécurité de l’aliment considéré.
Pour des raisons pratiques, le terme «aliment» inclut l’alimentation humaine et animale.
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 20976-1:2019(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et
lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve
microbiologique —
Partie 1:
Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance,
le temps de latence et le taux de croissance maximal
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests de croissance sur les bactéries
végétatives et sporulées dans les matières premières, les produits intermédiaires ou produits finis.
L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 18787:2017, Produits agricoles et alimentaires — Détermination de l'activité de l'eau
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
spore bactérienne
forme de résistance prise par certaines bactéries qui reste en état de dormance jusqu’à l’étape de
germination (3.9)
3.2
lot
groupe ou série de produits identifiables obtenus par un procédé donné dans des conditions
pratiquement identiques et produits dans un endroit donné et au cours d’une période de production
déterminée
Note 1 à l'article: Le lot est déterminé par des paramètres établis au préalable par l’organisation et il peut être
décrit par d’autres termes.
o
[SOURCE: Règlement (CE) n 2073/2005 de la Commission]
3.3
valeur cardinale
valeurs minimale, optimale et maximale d’un paramètre physico-chimique (par exemple, température,
pH, a ) caractérisant la croissance d’une souche microbienne donnée
w
3.4
unité témoin
unité d’aliment identique à l’unité pour essai (3.24), mais qui n’est pas contaminée artificiellement
(utilisée comme blanc)
3.5
test d’épreuve microbiologique
étude de la croissance ou étude de l’inactivation d’un ou plusieurs microorganismes inoculés
artificiellement dans un aliment, la première s’effectuant lors d’un test de croissance, la seconde lors
d’un test d’inactivation
3.6
point expérimental
résultat d’analyse d’une unité pour essai (3.24) par unité de poids (log ufc/g), par unité de volume
(log ufc/ml) ou par unité de surface (log ufc/cm )
10 10
Note 1 à l'article: Pour des cas spécifiques, les résultats de dénombrement peuvent être exprimés en log NPP.
3.7
phase de croissance exponentielle
phase dans laquelle la population microbienne se multiplie exponentiellement aussi rapidement que
possible; la croissance dépend du milieu et de l’environnement de croissance (température, humidité, etc.)
Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.
3.8
temps de génération
Tg
temps nécessaire à la multiplication par 2 des microorganismes, également désigné par temps de
doublement
3.9
germination
mécanisme dans lequel une spore bactérienne (3.1) germe pour devenir une cellule végétative (3.25)
3.10
potentiel de croissance
Δ
différence entre le logarithme décimal de la concentration la plus élevée de la population microbienne
cible (log ) et le logarithme décimal de la concentration initiale de cette population microbienne (log )
max i
Note 1 à l'article: Le log et le log font référence à des concentrations et sont exprimés en log ufc/g ou
max i 10
log ufc/ml ou log ufc/cm .
10 10
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3.11
taux de croissance maximal
paramètre de cinétique caractérisant la phase de croissance exponentielle (3.7), représenté par la pente
de la courbe montrant l’évolution du logarithme naturel (μ ) ou du logarithme décimal (V ) de la
max max
population en fonction du temps, dans des conditions de croissance constantes
3.12
inoculum
suspension microbienne à la concentration souhaitée utilisée pour contaminer les unités pour essai (3.24)
3.13
phase de latence
phase, directement après l’inoculation, durant laquelle la population microbienne s’adapte à
l’environnement, avant d’entrer en phase de croissance exponentielle (3.7)
Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.
3.14
temps de latence
λ
paramètre de cinétique en unité de temps qui caractérise la phase de latence (3.13)
3.15
valeur de pH
mesure de la concentration d’acidité ou de basicité d’un matériau en solution aqueuse
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modifié — Les Notes 1 et 2 à l’article ont été supprimées.]
3.16
modèle primaire
modèle mathématique décrivant les changements du dénombrement de la population microbienne en
fonction du temps
3.17
laboratoire organisateur
laboratoire ayant la responsabilité de gérer les tests d'épreuve microbiologique (3.5)
3.18
échantillonnage
sélection d’une ou plusieurs unités ou portions d’aliment, de telle sorte que les unités ou portions
sélectionnées sont représentatives de cet aliment
3.19
point d’échantillonnage
moment auquel les unités pour essai (3.24) sont analysées et qui est représenté en tant que point
expérimental (3.6) sur le graphique de cinétique
3.20
modèle secondaire
modèle mathématique décrivant les effets des facteurs environnementaux (par exemple, température,
pH, a ) sur les paramètres du modèle primaire (3.16) (par exemple, le taux de croissance)
w
3.21
sporulation
mécanisme par lequel une cellule végétative (3.25) forme une spore
3.22
phase stationnaire
phase dans laquelle la population microbienne est à son niveau maximal
Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.
3.23
prise d’essai
échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) et prélevé sur l’unité pour essai (3.24) pour servir
à l’analyse
[SOURCE: ISO 6887‑1:2017, 3.5, modifié — La fin de la définition, «sur l’échantillon pour laboratoire pour
servir à la préparation de la suspension mère», a été modifiée, et la Note 1 à l’article a été supprimée.]
3.24
unité pour essai
quantité (volume ou masse) mesurée de l’aliment utilisé pour l’inoculation
3.25
cellule végétative
état d’une forme microbienne qui est capable de croître dans des conditions environnementales
favorables
3.26
activité de l’eau
a
w
rapport entre la pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire et la pression de vapeur de l’eau
pure à la même température
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modifié — La définition a été condensée, et la formule et les Notes 1 et 2
à l’article ont été supprimées.]
4 Principe
4.1 Généralités
L’objectif de cette étude doit être clairement défini (par exemple, évaluation/validation de la durée de
conservation de l’aliment en tant que mesure de maîtrise, évaluation de la stabilité microbienne). Le
plan expérimental doit être en conformité avec cet objectif et doit tenir compte des étapes de la chaîne
alimentaire pour lesquelles la croissance microbienne est évaluée. Les critères de décision doivent être
clairement définis (voir 7.2).
La connaissance de l’exploitant du secteur alimentaire concernant ses produits (par exemple,
caractéristiques ou procédé de production) doit être combinée avec l’expertise en microbiologie des
aliments et sciences analytiques pour garantir la robustesse de l’étude. Le laboratoire organisateur doit
avoir des connaissances et compétences en microbiologie des aliments, sciences et technologies des
aliments, ainsi qu’en statistique pour concevoir et conduire les études, interpréter les résultats et tirer
les conclusions. Les analyses doivent être conduites dans le cadre d’un système d’assurance qualité (par
exemple, conformément à l’ISO/IEC 17025).
Les tests de croissance visent à étudier le potentiel de croissance ou la cinétique de croissance (temps
de latence et taux de croissance maximal), afin d’évaluer par exemple la durée de conservation de
l’aliment en tant que mesure de maîtrise, ou la stabilité microbienne d’un aliment.
Les études du potentiel de croissance sont particulièrement appropriées pour:
— valider la durée de conservation microbiologique d’un aliment dans des conditions raisonnablement
prévisibles d’utilisation et de conservation entre la production et la consommation, en garantissant
que les critères microbiologiques pertinents sont satisfaits tout au long de la durée de conservation
du produit;
— évaluer si un produit, soumis à essai dans des conditions spécifiques, permet la croissance du
microorganisme inoculé.
Un potentiel de croissance ne sera valide que pour les caractéristiques spécifiques de l’aliment et
les conditions appliquées pour l’étude. Si les critères microbiologiques ne sont pas satisfaits ou si
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
les conditions (par exemple, formulation de l’aliment, caractéristiques physico-chimiques, type et/
ou concentration des conservateurs ajoutés, conditionnement, température de conservation) sont
modifiées, une nouvelle étude du potentiel de croissance doit être conduite afin de valider ces nouvelles
conditions.
Les études de cinétique de croissance sont particulièrement appropriées pour:
— évaluer le ou les effets des caractéristiques intrinsèques (par exemple, pH, a , conservateurs) et
w
extrinsèques (par exemple, composition en gaz, température) ayant un impact significatif sur le
comportement du microorganisme cible;
— fournir des données pour les modèles développés pour simuler l’impact de ces facteurs sur le
comportement microbien dans l’aliment étudié pour des conditions de conservation raisonnablement
prévisibles (temps et température);
— comparer les résultats de simulation pour garantir que les critères microbiologiques pertinents
sont satisfaits tout au long de la durée de conservation de l’aliment.
Les études de cinétique de croissance sont utilisées pour estimer et valider la durée de conservation
microbiologique d’un aliment. Elles sont particulièrement adaptées dans les dernières étapes du
développement d’un aliment, y compris la reformulation, un nouveau conditionnement et d’autres
conditions de transformation.
Une étude de cinétique de croissance peut fournir davantage d’informations qu’une étude de potentiel
de croissance. Toutefois, les études de cinétique de croissance sont plus complexes en termes de plan de
l’étude, d’exécution, d’interprétation et d’exploitation des résultats, en particulier dans le cas où divers
facteurs sont inclus.
Le comportement d’une population microbienne dans un aliment, c’est-à-dire la cinétique de croissance
du microorganisme, dépend des caractéristiques de l’aliment (par exemple, a , pH, concentrations
w
en conservateurs, etc.), des conditions de conservation de l’aliment (température, format de
conditionnement et composition en gaz), des procédés alimentaires, de l’état physiologique des
microorganismes et des interactions avec la flore annexe pouvant être présente naturellement dans
l’aliment.
La cinétique de croissance microbienne est définie par trois phases majeures (voir Figure 1).
a) Phase de latence: Cette phase est caractérisée par le temps de latence (λ), qui correspond au point
d’intersection entre la tangente de la phase de croissance exponentielle (tracée en coordonnées
[15]
semi-logarithmiques) et la ligne horizontale passant par la concentration cellulaire initiale
[18]
. Pour les microorganismes sporulés, le temps de latence inclut la germination des spores et
l’émergence.
Le temps de latence dépend des caractéristiques de l’aliment (par exemple, physico-chimiques
et microbiologiques), des taux d’inoculation et des conditions de conservation (par exemple,
température, humidité relative, composition en gaz). Le temps de latence dépend également de
l’état physiologique du microorganisme contaminant l’aliment et de toutes conditions de stress
pouvant impacter le comportement des cellules ou spores.
b) Phase de croissance exponentielle: Cette phase est caractérisée par le taux de croissance maximal
(µ ou V ), qui correspond à l’augmentation maximale du logarithme naturel ou décimal du
max max
nombre de cellules par unité de temps.
Le taux de croissance correspond à la pente de la courbe montrant l’évolution du logarithme
naturel (µ ) ou décimal (V ) de la population en fonction du temps pendant la phase de
max max
croissance exponentielle. Les caractéristiques de l’aliment (par exemple, physico-chimiques et
microbiologiques) et les conditions de conservation (par exemple, température, humidité relative,
composition en gaz) peuvent influencer significativement le taux de croissance microbienne. Le
taux de croissance d’une population microbienne n’est ni affecté par sa concentration initiale ni par
son état physiologique.
La relation entre le temps de génération (Tg) et µ est fournie par la Formule (1):
max
μ =ln()2 /Tg (1)
max
La pente de la courbe représentant le log de la population bactérienne en fonction du temps, V ,
10 max
et sa relation avec le taux de croissance maximal, est fournie par la Formule (2):
μ =⋅V ln 10 (2)
()
maxmax
c) Phase stationnaire: Dans cette phase, la population microbienne est à son niveau maximal.
Légende
Y log (ufc/g)
X temps (jours)
1 phase de latence
2 phase de croissance exponentielle
3 phase stationnaire
Figure 1 — Cinétique de croissance microbienne avec trois phases majeures
4.2 Estimation du potentiel de croissance
Les caractéristiques de l’aliment (par exemple, physico-chimiques et microbiologiques) et les conditions
de conservation (par exemple, température, humidité relative, composition en gaz) peuvent influencer
significativement le potentiel de croissance microbienne.
L’inoculum doit être adapté à des conditions reproduisant l’exposition à différents stress que la cellule
microbienne ou la spore pourraient rencontrer lors de la manipulation/transformation des aliments
ou tout phénomène pouvant induire d’éventuelles adaptations des microorganismes, afin d’obtenir des
comportements microbiens proches de ceux observés dans l’aliment en conditions naturelles.
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés
Ce type d’essai est conçu pour estimer l’évolution de la population microbienne au cours du test
de croissance. Ces essais peuvent être employés pour déterminer si la croissance microbienne est
importante dans une denrée alimentaire et pour quantifier l’augmentation de la concentration de cette
population microbienne dans des conditions de conservation données.
Il est important d’avoir un minimum de 5 points d’échantillonnage répartis uniformément sur l’ensemble
de la durée de conservation, pour obtenir une estimation précise du potentiel de croissance (voir 14.2).
Le potentiel de croissance ne donne aucune information sur la durée de la phase de latence, la valeur du
taux de croissance ou le niveau maximal de la phase stationnaire. De ce fait, le potentiel de croissance
ne permet pas d’extrapoler les résultats à d’autres situations.
Le potentiel de croissance peut être obtenu en utilisant des profils de température dynamiques
appliqués à l’aliment durant l’étude, reproduisant les conditions de conservation de l’aliment.
4.3 Estimation des paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux
de croissance maximal)
La caractérisation de la cinétique de croissance consiste à estimer le temps de latence et le taux de
croissance maximal. Le taux de croissance maximal est essentiellement utilisé pour évaluer, déterminer
et optimiser la durée de conservation microbiologique de l’aliment.
Le taux de croissance maximal peut être utilisé directement pour calculer une augmentation de la
concentration microbienne dans les conditions du test de croissance et/ou utilisés comme donnée
d’entrée pour toute simulation de croissance.
Le plan expérimental doit générer au moins huit points expérimentaux répartis sur l’ensemble du test
de croissance, avec un minimum de cinq points dans la phase exponentielle. La cinétique de croissance
doit être estimée à une température constante en ajustant un modèle mathématique reconnu et
couramment accepté et utilisé pour décrire la croissance microbienne.
5 Appareillage
Un matériel courant de laboratoire de microbiologie spécifié dans l’ISO 7218 est requis. Un matériel
spécifique peut également être nécessaire pour préparer les prises d’essai, les conserver dans des
conditions adéquates ou surveiller l’évolution de leurs caractéristiques durant l’étude du test de
croissance. Il inclut ce qui suit.
5.1 Appareillage pour le conditionnement des échantillons à l’air, sous vide ou sous une atmosphère
modifiée protectrice.
5.2 Étuve réfrigérée capable d’atteindre et de maintenir les températures de consigne à ±1 °C.
5.3 Enceinte climatique capable d’atteindre et de maintenir les températures de consigne à ±1 °C et
d’ajuster l’humidité relative à ±10 %.
5.4 pH-mètre capable d’effectuer des mesurages avec une tolérance de ±0,1 unité de pH; les pH-
mètres doivent fournir des mesures avec une résolution de 0,01 unité de pH.
5.5 a mètre, satisfaisant aux exigences de l’ISO 18787.
w
5.6 Analyseur de gaz d’espace de tête, pour mesurer la composition en gaz (par exemple O , CO ).
2 2
5.7 Enregistreur pour la mesure de la température de conservation de l’unité d’essai
5.8 Enregistreur pour la mesure de l’humidité relative de conservation de l’unité d’essai
6 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques de laboratoire actuelles telles qu’elles sont spécifiées dans l’ISO 7218.
Pour la préparation et les essais de performance des milieux de culture et des réactifs, suivre les modes
opératoires spécifiés dans l’ISO 11133 et dans la Norme internationale spécifique de la population
microbienne étudiée. Utiliser des méthodes reconnues au niveau international et largement acceptées
ou d’autres méthodes validées conformément à des protocoles acceptés au niveau international pour la
détection ou le dénombrement des microorganismes cibles (par exemple, ISO 16140-2).
7 Plan de l’étude et échantillonnage
7.1 Généralités
Le plan de l’étude doit couvrir les sources de variabilité, notamment:
— la variabilité inter-lots;
— la variabilité intra-lot;
— la variabilité dans l’inoculation artificielle des unités d’essai.
7.2 Définition des critères de décision concernant le potentiel de croissance
En fonction de l’objectif du test de croissance, les critères de décision doivent être définis avant le
début de l’étude. Une approche en deux étapes est utilisée pour l’étude du potentiel de croissance: une
première étape pour déterminer si l’aliment permet une croissance microbienne et une seconde étape
pour déterminer dans quelle mesure la croissance est acceptable.
Par exemple, pour Listeria monocytogenes, certaines organisations considèrent qu’un aliment permet la
[10][12]
croissance lorsque le potentiel de croissance est supérieur à une valeur limite de 0,5 log , tandis
[13]
que d’autres placent cette valeur limite à 1 log .
7.3 Nombre de lots et critères de sélection
Le nombre de lots inclus dans l’étude dépend de la variabilité du procédé de production et de l’aliment,
en particulier en ce qui concerne les caractéristiques intrinsèques (par exemple, pH, a , conservateur)
w
et extrinsèques (par exemple, composition en gaz) et les propriétés microbiologiques de l’aliment. Cette
variabilité doit être documentée. Les caractéristiques des lots étudiés doivent être représentatives de
la variabilité rencontrée lors du procédé de production et basée sur l’historique des données d’auto-
contrôles.
Si la variabilité inter-lots des caractéristiques de l’aliment (par exemple, physico-chimiques et
microbiologiques) est suffisante pour induire des différences de comportement de croissance (lorsque
Δφ ou Δψ est supérieur à 0,2), il est nécessaire d’étudier plusieurs lots afin d’évaluer la variabilité
pHaw
[14]
au sein des réponses microbiennes . Dans ce cas, il convient d’utiliser un nombre minimal de trois
lots pour les études de potentiel de croissance et de cinétique de croissance.
L’emploi d’un seul lot doit être clairement justifié, par exemple:
a) évaluation de l’impact d’une nouvelle formulation de l’aliment;
b) utilisation d’un lot représentant les conditions de croissance les plus favorables (scénario le plus
défavorable);
c) applicable à une étude de cinétique de croissance uniquement si l’impact de la variabilité inter-lots
déterminé par le calculateur (voir Annexe A) n’est pas significatif.
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L’Annexe A fournit un schéma de calcul approprié pour évaluer l’impact de la variabilité inter-lots de
l’aliment, du pH et de l’a sur le comportement des microorganismes soumis à essai. L’Annexe A n’est
w
applicable que dans les cas où les tests de croissance sont conduits pour estimer le taux de croissance et
où le pH et l’a sont les seules caractéristiques pertinentes de l’aliment ayant un impact significatif sur
w
ce paramètre de cinétique.
7.4 Préparation des unités pour essai
Les unités pour essai sont représentatives de la matrice alimentaire et peuvent être:
— le contenu complet des unités de conditionnement;
— des portions échantillonnées de manière aseptique d’une ou plusieurs unités de conditionnement
ou d’aliment en vrac.
Les unités pour essai doivent être maintenues à une température de conservation appropriée avant
l’inoculation. Les unités pour essai doivent être inoculées à un temps le plus proche possible du jour
de production, sauf définition contraire par les objectifs de l’étude. Les unités d’essai doivent avoir la
même composition que l’aliment d’origine, en particulier pour les aliments composites.
Les unités d’essai doivent être conditionnées en utilisant les mêmes conditions de conditionnement que
l’aliment d’origine sur la durée de conservation soumise à essai. Il est recommandé d’utiliser le même
matériau de conditionnement, un mélange de gaz et un rapport espace de tête/aliment comparable. Si,
par exemple, pour des raisons pratiques, il n’est pas possible d’utiliser le conditionnement d’origine
(ou le même matériau de conditionnement), l’utilisation d’un autre matériau de conditionnement doit
être justifiée. Cet autre matériau de conditionnement doit avoir les mêmes propriétés techniques (par
exemple, perméabilité aux gaz) que celui d’origine.
Préparer le nombre d’unités à utiliser pour l’inoculation des microorganismes (unités d’essai) et pour
les témoins (unités témoins, voir Articles 10 et 11). Il est recommandé de préparer des unités pour essai
supplémentaires pour couvrir les imprévus.
7.5 Nombre d’unités pour essai à inoculer
Le nombre minimum d’unités pour essai à inoculer par point d’échantillonnage dépendra de la
variabilité inter-lots (voir Annexe B). En fonction de la variabilité intra-lot, il pourra être nécessaire
d’augmenter le nombre d’unités pour essai et/ou de points d’échantillonnage.
Les sources de variabilité des inoculations artificielles sont fonction du type et de la structure de la
matrice alimentaire soumise à essai, ainsi que du mode opératoire pour l’inoculation. Lorsque les trois
lots ne sont pas inoculés simultanément, il convient que le nombre d’unités pour essai à préparer pour
le Temps 0 (t ) soit d’au moins trois par lot.
L’Annexe B présente un schéma illustrant la détermination du nombre minimum d’unités pour essai à
inoculer qui sont nécessaires pour le test de croissance, en fonction de la variabilité inter-lots attendue,
du type de test de croissance et du nombre minimum de points d’échantillonnage.
NOTE La croissance microbienne peut être suivie par une inactivation (selon la composition et les conditions
de conservation de l’aliment). Les points d’échantillonnage sont répartis sur la période de conservation afin de
détecter une diminution possible de la concentration après la croissance initiale.
Voir l’Article 11 pour connaître le nombre d’unités d’essai à préparer pour les essais témoins.
8 Choix des souches
Chaque souche utilisée doit avoir une caractérisation biochimique et/ou sérologique et/ou génétique
avec un niveau de détail suffisant pour que son identité soit connue. Les souches précédemment
isolées de matrice alimentaire (matières premières, ingrédients, produits finis) ou de l’environnement
de production ou d’échantillons cliniques/alimentaires/environnementaux issus de toxi-infections
impliquant cet aliment sont préférées aux souches issues de collection. Il convient de connaître la
source d’origine de tous les isolats et de conserver les isolats dans une souchothèque locale (par
exemple, laboratoire réalisant le test de croissance), nationale ou internationale, afin de permettre leur
utilisation dans des essais futurs, si nécessaire. Il convient de déterminer la capacité de croissance des
souches avant les tests de croissance par les données historiques ou publiées ou en les soumettant à
essai comme décrit en 9.2 et 9.3.
La ou les souches sélectionnées doivent être adaptées à l’usage en ce qui concerne leur capacité de
croissance dans les conditions de l’essai, incluant le pH, la température, l’a , etc. Dans
...
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