ISO/TS 21569-3:2020
(Main)Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-pat-sequence for screening for genetically modified organisms
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-pat-sequence for screening for genetically modified organisms
This document describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene (pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently found in genetically modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The P35S-pat construct specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and quantitative screening purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up analysis can be carried out. This document is applicable to the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It can also be suitable for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the relevant matrix.
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Partie 3: Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour la détection de la séquence P35S-pat pour criblage des organismes génétiquement modifiés
Le présent document décrit un mode opératoire permettant la détection d'une séquence d'ADN de transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur et un gène modifié codant pour l'enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces viridochromogenes. Le construit P35S-pat est fréquemment observé dans les plantes génétiquement modifiées présentant une tolérance aux herbicides contenant de la phosphinothricine. La méthode spécifique du construit P35S-pat est basée sur une méthode par PCR en temps réel et peut être utilisée à des fins de criblage qualitatif et quantitatif. Pour l'identification et la quantification d'un événement spécifique, une analyse complémentaire peut être effectuée. Le présent document est applicable à l'analyse de l'ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être également utilisé pour analyser l'ADN extrait d'autres produits tels que des aliments pour animaux et des semences. L'application de cette méthode exige qu'une quantité adéquate d'ADN amplifiable de qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 21569-3
Second edition
2020-06
Horizontal methods for molecular
biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of
genetically modified organisms and
derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR
method for detection of P35S-pat-
sequence for screening for genetically
modified organisms
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3: Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour la
détection de la séquence P35S-pat pour criblage des organismes
génétiquement modifiés
Reference number
©
ISO 2020
© ISO 2020
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and materials . 2
5.1 General . 2
5.2 PCR reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Procedure. 3
7.1 Test sample procedure . 3
7.2 Preparation of the DNA extracts . 3
7.3 PCR setup . 3
7.4 Temperature-time programme . 4
8 Accept/reject criteria . 4
8.1 General . 4
8.2 Identification . 4
8.3 Calculation of P35S-pat copy numbers . 5
9 Validation status and performance criteria . 5
9.1 Robustness of the method . 5
9.2 Collaborative trial for determination of LOD . 5
9.3 Collaborative trial for quantification of the P35S-pat construct in rapeseed . 6
9.4 Sensitivity . 7
9.5 Specificity . 7
10 Test report . 8
Annex A (informative) GenBank BLASTN Search . 9
Annex B (informative) Joint Research Commission GMO-Matrix .11
Bibliography .14
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO/TS 21569-3:2015), which has been
technically revised. The main changes compared with the previous edition are as follows:
— the section on in silico search has been updated;
— minor typographical changes have been made throughout.
A list of all parts in the ISO 21569 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 21569-3:2020(E)
Horizontal methods for molecular biomarker analysis —
Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products —
Part 3:
Construct-specific real-time PCR method for detection of
P35S-pat-sequence for screening for genetically modified
organisms
1 Scope
This document describes a procedure for the detection of the DNA transition sequence between the 35S
promotor (P35S) from Cauliflower mosaic virus and a modified phoshinothricin-acetyltransferase gene
(pat) from Streptomyces viridochromogenes. The P35S-pat construct is frequently found in genetically
modified plants with tolerance for phosphinothricin-containing herbicides. The P35S-pat construct
specific method is based on a real-time PCR and can be used for qualitative and quantitative screening
purposes. For identification and quantification of a specific event, a follow-up analysis can be carried out.
This document is applicable to the analysis of DNA extracted from foodstuffs. It can also be suitable
for the analysis of DNA extracted from other products such as feedstuffs and seeds. The application of
this method requires the extraction of an adequate quantity and quality of amplifiable DNA from the
relevant matrix.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Terms and definitions
ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Qualitative nucleic acid based methods
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Nucleic acid extraction
ISO 24276, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle
DNA is extracted from the test portion by applying a suitable method. The DNA analysis consists of
two parts:
a) verification of the amount and amplifiability of the extracted DNA, e.g. by means of a target tax on
[1]
specific real-time PCR (see ISO 21570 ):
[2][3]
b) detection of the P35S-pat construct in a real-time PCR .
5 Reagents and materials
5.1 General
Chemicals of recognized analytical grade, appropriate for molecular biology shall be used, as a rule.
The water used shall be double distilled or PCR grade water (i.e. nuclease and nucleic acid free). For all
operations in which gloves, the gloves should be powder free. The use of aerosol-protected pipette tips
as protection against cross contamination is recommended.
5.2 PCR reagents
5.2.1 Thermostable DNA polymerase, for hot-start PCR.
5.2.2 PCR buffer solution, containing magnesium chloride and deoxyribonucleoside triphosphates
(dATP, dCTP, dGTP and dUTP).
Ready-to-use reagent mixtures or mixes of individual components can be used. Reagents and
polymerases that lead to equal or better results may also be used.
5.2.3 Oligonucleotides (see Table 1).
Table 1 — Oligonucleotides
Final concentration
Name DNA sequence of the oligonucleotide
in PCR
[2][3]
P35S-pat construct as the target sequence
Primer 35SP03.f 5′-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3′ 200 nmol/l
Primer pat-7.r 5′-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3′ 200 nmol/l
5′-(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT Agg
Probe GSS01.s 100 nmol/l
a
C-(TAMRA)-3′
a
FAM: 6-Carboxyfluorescein, TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamine.
NOTE Equivalent reporter dyes and/or quencher dyes can be used for the probe if they can be shown to yield
similar or better results.
5.2.4 Standard DNA for calibration
A standard DNA solution of a known concentration (ng/µl) can be used to calculate the copy number of
the P35S-pat target sequence.
2 © ISO 2020 – All rights reserved
When using genomic plant DNA as the standard DNA, the number of haploid genome equivalents should
be calculated on the basis of the molecular mass of the plant haploid genome by applying Formula (1):
c ×1 000
DNA
n = (1)
g
m
hg
where
n is number of genome equivalents per microlitre;
g
m is the haploid genome mass in picograms;
hg
c is the DNA con
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 21569-3
Deuxième édition
2020-06
Méthodes horizontales d'analyse
moléculaire de biomarqueurs —
Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-
spécifique pour la détection de la
séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
Horizontal methods for molecular biomarker analysis — Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products —
Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-
pat-sequence for screening for genetically modified organisms
Numéro de référence
©
ISO 2020
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Réactifs PCR . 2
6 Appareillage . 3
7 Mode opératoire. 3
7.1 Mode opératoire applicable à l’échantillon pour essai . 3
7.2 Préparation des extraits d’ADN . 3
7.3 Réaction PCR . 3
7.4 Programme d’amplification . 4
8 Critères d’acceptation/de rejet . 4
8.1 Généralités . 4
8.2 Identification . 5
8.3 Calcul du nombre de copies pour la séquence P35S-pat . 5
9 État de validation et critères de performance . 5
9.1 Robustesse de la méthode . 5
9.2 Essai interlaboratoires pour la détermination de la limite de détection (LOD) . 5
9.3 Essai interlaboratoires pour la quantification du construit P35S-pat dans le colza . 6
9.4 Sensibilité . 8
9.5 Spécificité . 8
10 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Recherche avec BLASTN dans la base de données GenBank .10
Annexe B (informative) Matrice d’OGM du Centre commun de recherche .12
Bibliographie .15
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse moléculaire de biomarqueurs.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO/TS 21569-3:2015), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les
suivantes:
— la section sur la recherche in silico a été mise à jour;
— des modifications typographiques mineures ont été apportées tout au long du document.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 21569 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 21569-3:2020(F)
Méthodes horizontales d'analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés —
Partie 3:
Méthode PCR en temps réel construit-spécifique pour
la détection de la séquence P35S-pat pour criblage des
organismes génétiquement modifiés
1 Domaine d’application
Le présent document décrit un mode opératoire permettant la détection d’une séquence d’ADN de
transition entre le promoteur 35S (P35S) du virus de la mosaïque du chou-fleur et un gène modifié
codant pour l’enzyme phosphinothricine-acétyltransférase (pat) et provenant de Streptomyces
viridochromogenes. Le construit P35S-pat est fréquemment observé dans les plantes génétiquement
modifiées présentant une tolérance aux herbicides contenant de la phosphinothricine. La méthode
spécifique du construit P35S-pat est basée sur une méthode par PCR en temps réel et peut être utilisée
à des fins de criblage qualitatif et quantitatif. Pour l’identification et la quantification d’un événement
spécifique, une analyse complémentaire peut être effectuée.
Le présent document est applicable à l’analyse de l’ADN extrait de produits alimentaires. Il peut être
également utilisé pour analyser l’ADN extrait d’autres produits tels que des aliments pour animaux
et des semences. L’application de cette méthode exige qu’une quantité adéquate d’ADN amplifiable de
qualité appropriée soit extraite de la matrice étudiée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16577 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
4 Principe
L’ADN est extrait de la prise d’essai en appliquant une méthode appropriée. L’analyse de l’ADN se divise
en deux parties, à savoir:
a) vérification de la quantité et de l’amplificabilité de l’ADN extrait, par exemple par PCR en temps réel
[1]
spécifique pour le taxon cible (voir l’ISO 21570 );
[2][3]
b) détection du construit P35S-pat par PCR en temps réel .
5 Réactifs et matériaux
5.1 Généralités
En règle générale, des substances chimiques de qualité analytique reconnue, appropriées pour
la biologie moléculaire, doivent être utilisées. L’eau utilisée doit être bidistillée ou de qualité PCR
(c’est-à-dire exempte de nucléases et d’acides nucléiques). Pour toutes les opérations nécessitant le
port de gants, il convient de s’assurer que ceux-ci ne sont pas poudrés. Pour éviter toute contamination
croisée, il est recommandé d’utiliser des embouts de pipette protégés contre les aérosols.
5.2 Réactifs PCR
5.2.1 ADN polymérase thermostable, pour PCR à démarrage à chaud (hot start PCR).
5.2.2 Solution tampon pour PCR, contenant du chlorure de magnésium et des désoxyribonucléosides
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dUTP).
Il est possible d’utiliser des mélanges de réactifs ou des préparations de composants individuels prêts
à l’emploi. Des réactifs et des polymérases conduisant à des résultats équivalents ou meilleurs peuvent
également être utilisés.
5.2.3 Oligonucléotides (voir Tableau 1).
Tableau 1 — Oligonucléotides
Concentration
Nom Séquence d’ADN de l’oligonucléotide
finale dans la PCR
[2][3]
Construit P35S-pat comme séquence cible :
Amorce 35SP03.f 5′-AAg
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.