ISO 21571:2005
(Main)Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction
ISO 21571:2005 provides general requirements and specific methods for DNA extraction/purification and quantification. These methods are described in Annexes A and B. ISO 21571:2005 has been established for food matrices, but could also be applicable to other matrices, such as grains and feed. It has been designed as an integral part of nucleic-acid-based analytical methods, in particular ISO 21569 on qualitative analytical methods, and ISO 21570 on quantitative analytical methods.
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
L'ISO 21571:2005 indique les exigences générales et les méthodes spécifiques pour l'extraction, la purification et la quantification de l'ADN. Ces méthodes sont décrites dans les Annexes A et B.. L'ISO 21571:2005 a été élaborée pour les matrices alimentaires, mais peut également s'appliquer à d'autres matrices (par exemple grains et aliments pour animaux). Elle a été conçue dans le cadre d'une série de méthodes d'analyse fondées sur l'utilisation de l'acide nucléique, notamment l'ISO 21569 (méthodes d'analyse qualitative) et l'ISO 21570 (méthodes d'analyse quantitative).
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21571
First edition
2005-02-15
Foodstuffs — Methods of analysis for
the detection of genetically modified
organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés —
Extraction des acides nucléiques
Reference number
©
ISO 2005
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Principle . 1
3.1 General. 1
3.2 DNA extraction . 2
3.3 DNA quantitation. 2
4 General laboratory requirements . 2
5 Procedure. 2
5.1 Preparation of the test portion. 2
5.2 DNA extraction/purification. 4
5.3 Quantitation of the extracted DNA . 5
5.4 Stability of extracted DNA. 6
6 Interpretation . 6
7 Test report. 6
Annex A (informative) Methods for DNA extraction. 7
Annex B (informative) Methods for the quantitation of the extracted DNA. 34
Bibliography . 41
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
ISO 21571 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna
Agreement).
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Introduction
The search for genetically modified origin of ingredients is performed by means of the following successive (or
simultaneous) steps. After sample collection, nucleic acids are extracted from the test portion. Extracted
nucleic acids can be further purified, simultaneously or after the extraction process. Afterwards, they are
quantified (if necessary), diluted (if necessary) and subjected to analytical procedures (such as PCR). These
steps are detailed in this and the following International Standards:
ISO 21568, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Sampling.
ISO 21569, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Qualitative nucleic acid based methods.
ISO 21570, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Quantitative nucleic acid based methods.
Further information about definitions and general items involving the steps cited above are collected in:
ISO 24276, Foodstuffs — Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions.
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of a patent concerning the silica-based extraction method
(No. EP 0389063/USP 5,234,809) given in Clause A.4.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of this patent right.
The holder of this patent right has assured the ISO that he/she is willing to negotiate licences under
reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants throughout the world. In this respect,
the statement of the holder of this patent right is registered with ISO. Information may be obtained from:
Jean Deleforge,
BioMérieux
Chemin de l'Orme,
69280 Marcy-l'Étoile, France.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21571:2005(E)
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products —
Nucleic acid extraction
1 Scope
This International Standard provides general requirements and specific methods for DNA
extraction/purification and quantitation. These methods are described in Annexes A and B.
This International Standard has been established for food matrices, but could also be applicable to other
matrices, such as grains and feed.
It has been designed as an integral part of nucleic-acid-based analytical methods, in particular ISO 21569 on
qualitative analytical methods, and ISO 21570 on quantitative analytical methods.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
1)
ISO 24276:— , Foodstuffs — Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions
ISO 21568, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Sampling
3 Principle
3.1 General
The objective of nucleic acid extraction methods is to provide nucleic acids suitable for subsequent analysis
(see ISO 24276).
NOTE The “quality” of DNA depends on the average length of the extracted DNA molecules, the chemical purity and
the structural integrity of the DNA sequence and of the double helix (e.g. intra-, inter-strand linking between DNA bases,
single-strand gaps, cross-linking with polyols, haemin, etc). Moreover, such alterations are often sequence-specific and
consequently not randomly distributed all over the genome (see References [1], [2], [3] and [4]).
Users of this International Standard should note that some methods (e.g. all silica-based methods), might be
covered by patent rights.
1) To be published.
3.2 DNA extraction
The basic principle of DNA extraction consists of releasing the DNA present in the matrix and further,
concurrently or subsequently, purifying the DNA from polymerase chain reaction (PCR) inhibitors.
DNA extraction/purification methods are described in Annex A. Method-selection is an experience-based
choice of the user, taking into account the scope and examples of matrices as given in each method.
Alternative protocols are suitable provided that the method has been validated on the respective matrix under
investigation.
3.3 DNA quantitation
Quantitation of extracted DNA could be useful for subsequent PCR analysis.
It may be performed by either physical (e.g. measure of absorbance at a specific wavelength), chemical-
physical (e.g. use of intercalating or binding agents able to emit fluorescence), enzymatic
(e.g. bioluminescence detection) methods or by quantitative PCR. The latter method is especially suitable for
composite matrices or for samples with a low DNA content or whose DNA is degraded.
There are several methods available to quantify the DNA present in a solution, as described in Annex B. It is
for the user to choose the most appropriate one to be applied, depending on the amount and quality of DNA to
be quantified and, consequently, on the matrix from which the DNA has been extracted.
Alternative protocols are suitable, provided that the method has been validated on the respective matrix under
investigation.
4 General laboratory requirements
Accidental contamination of DNA can originate from dust and spreading aerosols. As a consequence, the
organization of the work area in the laboratory is logically based on
the systematic containment of the methodological steps involved in the production of the results, and
a “forward flow” principle for sample handling.
The latter ensures that the DNA to be analysed and the amplified DNA generated by PCR remain physically
segregated.
Further details can be found in ISO 24276.
5 Procedure
5.1 Preparation of the test portion
5.1.1 General
Commodity-specific variables (e.g. humidity) and processing can impact the amount and quality of DNA
extracted from the material under investigation. Therefore the performance characteristics of a given DNA
extraction method depend on the matrix.
Take appropriate measures to ensure that the test portion is representative of the laboratory sample.
The test portion shall be of sufficient size and shall contain a sufficient number of particles to be
representative of the laboratory sample (e.g. 3 000 particles at an LOD of 0,1 %) to allow a statistically valid
conclusion to be made (see ISO 21568).
2 © ISO 2005 – All rights reserved
For practical/technical reasons, it is not recommended to exceed a size of 2 g.
Any restrictions that arise from the size of the test portion which prevent it from being representative shall be
reported and taken into consideration in the interpretation of the analytical results. The methods for DNA
extraction in Annex A describe test portions from 200 mg to 500 mg, which are usually adequate for DNA-rich
raw materials (e.g. ground grains, flour). However, for certain matrices containing very low amounts or
degraded DNA, insufficient DNA suitable for analysis can be extracted. In these cases, the test portion may be
increased.
DNA extractions shall be carried out at least on two test portions.
Storage of standards, samples and test portions shall comply with ISO 24276 and shall be organized in such a
way as to preserve the biochemical parameters to be analysed (for details, see ISO/IEC 17025).
5.1.2 Samples
All operations for the preparation of test samples (e.g. grinding, homogenization, division, drying) shall be
carried out in accordance with the procedures described in ISO 24276, taking care to prevent all
contamination of the sample or modification of its composition.
Laboratory samples shall be sufficiently homogeneous before reducing the laboratory sample and taking the
test portion.
For liquid samples, shake the vessel containing the sample to improve the homogenization of the product. In
the case of non-homogenous products like raw oils, check that the sediments have been completely removed
from the walls of the vessel.
For solid matrices that cannot easily be suspended, the matrix shall be ground to reduce the particle size
and/or facilitate the extractability of DNA. In such a case, attention shall be paid to the particle size. The test
portion subjected to extraction shall contain a minimum number of particles as specified in ISO 21568.
Milling/grinding devices should be capable of being thoroughly cleaned and shall be selected in order to
achieve the expected particle number and particle size distribution within the test portion as defined in
ISO 21568.
If components of the laboratory sample have been removed prior to extraction, then such procedures shall be
reported.
Final food products that are solid or paste and have high lipid contents are often not easy to grind to the
desired particle size in a single step. Several procedures may therefore be added, such as lipid removal using
hexane after intermediate grinding, freezing or freeze-drying before grinding.
In order to facilitate the grinding of paste or viscous products, it is possible to apply one of the following
treatments to certain matrices:
heating to a maximum temperature of 40 °C;
dissolving in an appropriate liquid such as water;
freezing at a temperature below or equal to −20 °C.
Homogenize the whole laboratory sample. Sample the two test portions, taking into account possible dilutions
or concentrations.
During milling/grinding, precautions should be taken to ensure that the heating of the sample is kept to a
minimum since heating can have a negative impact on the quality of the extracted DNA.
Milling/grinding techniques with a high risk of cross-contamination (such as the combined use of liquid
nitrogen and mortar) shall be avoided as far as possible. As a rule of good practice, any dust-producing
methodological step should be contained from all other analytical steps.
If salts, spices, powdered sugars and/or other substances that could potentially interfere with the extraction or
analytical method are present, appropriate purification steps should be considered according to the selected
method (see Annex A).
For example, in samples from composite matrices, the target matrix (e.g. the breading layer of fish sticks) can
be isolated for DNA extraction.
5.2 DNA extraction/purification
5.2.1 General
The following considerations apply for the design of extraction methods.
The quality and yield of nucleic acid extracted using a given method on a given matrix should be both
repeatable and reproducible in terms of analysis, provided sufficient nucleic acid is present in the matrix from
which it has been extracted.
In order to obtain a good quality DNA, it is advisable, where relevant, to remove the following:
polysaccharides (pectin, cellulose, hemi-cellulose, starch, thickeners, etc.) using appropriate enzyme
treatments (e.g. pectinase, cellulase, hemi-cellulase, α-amylase) or organic extraction
(e.g. CTAB/chloroform);
RNA and/or proteins using an appropriate treatment, such as enzymatic treatment by RNase and
proteinase, respectively;
the lipid fractions using for example enzyme treatments, or solvents (e.g. n-hexane);
salts (e.g. from the extraction/lysis buffer, from the precipitation step) able to interfere with the subsequent
analysis.
In particular for solid or dried samples, the volume of lysis/extraction buffer should be adapted to guarantee
the DNA is dissolved.
NOTE 1 DNA purification can be performed by different means such as fractionated precipitation, using solvents like
phenol, chloroform, ethanol, isopropanol, and/or by adsorption on solid matrices (anion exchange resin, silica or glass gel,
diatomaceous earth, membranes, etc.). Several DNA purification principles may be combined. If appropriate, extraction
and purification can be performed within the same step.
Should a DNA co-precipitant such as glycogen, PEG or t-RNA be used to improve the DNA recovery during
the precipitation steps, it should neither contain any detectable level of nuclease activity or PCR
inhibitors/competitors, nor bear any sequence similarity with the potential PCR target under study. For
genetically modified plants, a carrier DNA may be used (e.g. salmon or herring sperm DNA).
When using vacuum freeze dryers to dry the DNA pellets obtained after a precipitation step, the risk of cross
contamination should be taken into account.
Re-suspend the DNA in water or in a buffer solution that prevents DNA from degradation.
When setting up a new type of DNA extraction, or when applying one of the methods described in Annex A to
a new matrix, the potential quality and integrity of the extracted DNA using the chosen protocol should be
estimated by the following approach. A known quantity of a tracer DNA is added to the lysis buffer plus
sample used for DNA extraction. When the chosen tracer is a predetermined amount of DNA or represents a
predetermined number of copies of a particular DNA-sequence mixed to a matrix at start of DNA extraction,
attention shall be paid to ascertain the lack of DNA sequence similarity between the tracer DNA and the target
DNA sequence under study.
NOTE 2 The use of a tracer DNA is a good approximation to a real situation where DNA of a given matrix, complexed
to other components (e.g. proteins) is expected. Such a method may also be used to estimate the presence of soluble and
trans-acting PCR inhibitors in the extracted DNA (see ISO 24276, ISO 21569 and ISO 21570).
4 © ISO 2005 – All rights reserved
However, tracer DNA may give a misleading impression of recovery, since tracer DNA may be much easier to
separate from matrix than the target DNA.
5.2.2 Controls
The controls to be included are described in Table 1 of ISO 24276:—. These should as a minimum include an
extraction blank control and a positive extraction control, but may also include an environment control.
5.2.3 Control of DNA purity: Internal PCR control
When setting up a new type of extraction, the presence of PCR inhibitors in the extracted DNA may be
estimated using DNA spikes (see ISO 24276, ISO 21569 and ISO 21570). The amount of added DNA shall
not exceed the maximum level supported by PCR and shall contain a definite number of target sequence
copies. This number should be determined individually for each target sequence and indicated as a multiple of
the existing lower limit of detection. Ideally, the target concentration of the positive control PCR should
correspond to the sensitivity needed in the analysis. Care shall be taken when using highly concentrated
cloned target DNA. As far as possible, the positive controls shall conform to the conditions of the test material
with regard to the nucleic acids they contain.
5.3 Quantitation of the extracted DNA
5.3.1 General
The quality, integrity and amount of the nucleic acid template influences the performance of the analytical
method, and hence the analytical results obtained. The limit of detection of a specific method may therefore
depend on the amount of nucleic acids used.
Quantitation of DNA is helpful
to compare the efficiency of different DNA extraction protocols for a given matrix (repeatability), and
to measure the concentration of nucleic acids prior to analysis.
5.3.2 Range of application
Each method of quantitation shall be applied within its dynamic range, also considering its level of precision.
5.3.3 Quantity standards
The accuracy of the quantitation methods depends on the nucleic acid standards used to calibrate the method.
If using a method that is sensitive to the size and/or quality of the nucleic acid fragments, then the nucleic acid
standards that match the size and/or quality of the expected nucleic acid as extracted from the sample shall
be used.
The reference material used should ensure traceability to stated references, usually national or international
Standards, through an unbroken chain of comparison [see ISO Guide 30].
When a method using intercalating agents is employed, high molecular mass DNA standard should be used
when high molecular mass DNA is to be quantified. Low molecular mass DNA should be used when low
molecular mass DNA is to be quantified. High molecular mass nucleic acid usually also contains a certain
amount of lower molecular mass fragments. This means that many methods for DNA quantitation suffer from
a certain degree of inaccuracy, which should be taken into account.
NOTE Additionally, depending on the matrix and type of extraction method, a certain portion of the extracted DNA
may be recovered as single-stranded DNA (with much poorer intercalation capacity), leading to an underestimation of the
overall DNA content. In contrast, single-stranded DNA is equally well detected by physical measurements.
At least three points (preferably replicated) are required for the construction of a good calibration curve. The
amount of standard DNA used for each calibration point depends on the sensitivity of the method and on the
dynamic range under consideration.
5.4 Stability of extracted DNA
The DNA extracted shall be stored under such conditions that the stability is ensured to perform the
subsequent analyses.
Repeated freezing and thawing of DNA solutions should be avoided.
6 Interpretation
The DNA extraction method employed shall be appropriate to obtain the quality and quantity of nucleic acid
required for the subsequent analysis.
The quality of the extracted nucleic acid should be assessed using an analytical method that is influenced by
the same quality parameters as the analysis to be performed on the extracted nucleic acid (e.g. if the analysis
to be performed is PCR, then an additional PCR should be used for the assessment of the quality of the
extracted DNA).
Further parameters for method compatibility can be found in ISO 21569, ISO 21570 and ISO 24276.
7 Test report
When issuing the final test report in accordance with ISO 24276, the following additional information to
document the activity of the laboratory shall be included:
a statement describing the derivation of the test portions, and any preliminary processing of the sample
before nucleic acid extraction;
the size of the test portions used for the nucleic acid extraction;
the nucleic acid extraction method used;
any special observations made during testing;
any operation not specified in the method or considered to be optional but that can have an effect on the
results;
the interpretation of the results;
the experimentor's name.
Handling and storage of raw data are described in ISO/IEC 17025 and related quality assurance schemes.
Consistency should be achieved.
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Annex A
(informative)
Methods for DNA extraction
A.1 Preparation of PCR-quality DNA using phenol/chloroform-based DNA extraction
methods
A.1.1 Basic phenol/chloroform method
A.1.1.1 General
This routine method (see Reference [5]) is suitable for the extraction of DNA from a wide variety of matrices
(see A.1.1.8).
Phenol is usually very suitable for nuclease destruction and protein denaturation.
When foliar or green material (e.g. chicory leaves, dried alfalfa) is investigated, many PCR inhibitors may also
be co-precipitated together with DNA. For this reason, difficulties may be encountered in obtaining PCR-
amplifiable DNA reproducibly.
The corrosive hazardous properties of phenol must be taken into consideration, thus the use of DNA
extraction methods based on CTAB and/or PVP and/or silica adsorption are favoured as primary alternatives.
A.1.1.2 Validation status
The method has been widely applied in all areas of biology, agronomy and medicine, over the past 40 years,
but has never been evaluated through interlaboratory studies for GMO detection in foodstuffs.
A.1.1.3 Principle
The method consists of a lysis step (thermal lysis in presence of sodium dodecyl sulfate and a high EDTA
content) followed by the removal of contaminants (such as lipophylic molecules, polysaccharides and
proteins) and nucleases from the DNA-containing aqueous phase using phenol and chloroform. A final DNA
precipitation with ethanol concentrates the DNA and eliminates salts and residual chloroform. The critical step
[5]
of the method is the lysis step .
A.1.1.4 Safety precautions
A fume hood is necessary for handling organic chemicals.
A.1.1.5 Reagents
A.1.1.5.1 Ethanol, volume fraction φ (C H OH) = 96 %
2 5
Store and use at −20 °C.
A.1.1.5.2 Glacial acetic acid (CH COOH).
A.1.1.5.3 Potassium acetate (C H O K).
2 3 2
A.1.1.5.4 Hydrochloric acid, φ (HCl) = 37 %.
A.1.1.5.5 Isoamyl alcohol [(CH ) CHCH CH OH].
3 2 2 2
A.1.1.5.6 Phenol (C H OH).
6 5
A.1.1.5.7 Chloroform (CHCl ).
A.1.1.5.8 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
A.1.1.5.9 Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt (K EDTA) (C H N O K ).
2 10 14 2 8 2
A.1.1.5.10 Potassium hydroxide (KOH).
A.1.1.5.11 Potassium chloride (KCl).
A.1.1.5.12 Sodium dodecyl sulfate (SDS) (C H O SNa).
12 25 4
A.1.1.5.13 Proteinase K, approximately 20 Units/mg lyophilisate.
A.1.1.5.14 RNase-A, DNase-free, from bovine pancreas, approximately 50 Kunitz Units/mg of lyophilisate.
A.1.1.5.15 Equilibrated phenol, pH > 7,8.
Use phenol equilibrated against extraction buffer (A.1.1.5.18) without SDS, or prepared according to
Reference [5], or according to the manufacturers recommendations.
A.1.1.5.16 Chloroform-isoamyl alcohol
Mix 24 volume parts of chloroform (A.1.1.5.7) with 1 volume part of isoamyl alcohol (A.1.1.5.5).
A.1.1.5.17 Phenol-chloroform-isoamyl alcohol
Mix 1 volume part of equilibrated phenol (A.1.1.5.15) with 1 volume part of the chloroform-isoamyl alcohol
solution (A.1.1.5.16).
A.1.1.5.18 Extraction/lysis buffer, substance concentration c(Tris) = 0,050 mol/l, c(K EDTA) = 0,050 mol/l,
mass concentration ρ(SDS) = 30 g/l.
Adjust the pH to 8,0 with HCl or KOH.
A.1.1.5.19 TE buffer, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(K EDTA) = 0,001 mol/l.
Adjust the pH to 8,0 with HCl or KOH.
A.1.1.5.20 Proteinase-K solution, ρ = 20 mg/ml, dissolved in sterile water.
Do not autoclave. Store at −20 °C, but avoid repeated freezing and thawing.
8 © ISO 2005 – All rights reserved
A.1.1.5.21 RNase-A solution, ρ = 10 mg/ml lyophylisate.
Store at −20 °C, but avoid repeated freezing and thawing.
A.1.1.5.22 Ethanol solution, φ (C H OH) = 70 %.
2 5
Store and use at −20 °C.
A.1.1.5.23 Potassium acetate solution, c(C H O K) = 3 mol/l.
2 3 2
Adjust the pH to 5,2 with glacial acetic acid. Do not autoclave. If necessary, filter through a 0,22 µm filter.
A.1.1.6 Apparatus and equipment
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
A.1.1.6.1 Centrifuge, capable of achieving a minimum acceleration of 10 000 g.
In some steps a refrigerated centrifuge is required.
A.1.1.6.2 Water bath or incubator, working in a temperature range from 60 °C to 70 °C.
A.1.1.6.3 Vacuum dryer (optional).
A.1.1.6.4 Freeze dryer (optional).
2)
A.1.1.6.5 Mixer, e.g. Vortex
A.1.1.6.6 Reaction vessels, resistant to freezing in liquid nitrogen.
A.1.1.7 Procedure
A.1.1.7.1 General
Once the matrix test portion has been prepared, apply the following DNA extraction/purification protocol.
Scale-adaptation of masses and buffer volumes is required as a function of the selected size of the test
portion.
A.1.1.7.2 Extraction procedure
Weigh 0,25 g of the test sample into a microtube.
Add 1,6 ml of extraction buffer (A.1.1.5.18) and, when necessary (e.g. in protein-rich matrices), 50 µl of
proteinase K solution (A.1.1.5.20.) Incubate at 60 °C to 70 °C, usually for between 30 min to 2 h (overnight
incubation is also possible). Add RNase A (A.1.1.5.21) up to a final concentration of 0,1 µg/ml. Centrifuge at
5 000 g for 30 min and recover the supernatant in a fresh tube. Add 1 volume of equilibrated phenol
(A.1.1.5.15) to the supernatant, then mix gently and thoroughly. Centrifuge at 5 000 g for 15 min and recover
the upper aqueous phase in a fresh tube. Add 1 volume of phenol-chloroform isoamyl alcohol (A.1.1.5.17) to
the supernatant, then mix gently and thoroughly. Centrifuge at 5 000 g for 15 min and recover the aqueous
phase in a fresh tube. Repeat this step once or more times (depending on the matrix) until the interface
between the phases is clean.
2) Vortex is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
Add 1 volume of chloroform/isoamyl alcohol (A.1.1.5.16) to the supernatant, then mix gently and thoroughly.
Centrifuge at 5 000 g for 10 min and recover the upper aqueous phase in a fresh tube. Repeat, if necessary,
until the interface between the phases is clear. Mix the supernatant with 0,1 volume of potassium acetate
solution (A.1.1.5.23.) and 2,5 volumes of 96 % ethanol (A.1.1.5.1), then mix thoroughly by inversion. Incubate
for at least 5 min in liquid nitrogen, or 1 h at −80 °C, or overnight at −20 °C. Centrifuge at 10 000 g (or up to
13 000 g) at 4 °C for at least 15 min, then carefully discard the supernatant.
Carefully wash the DNA pellet with 2 volumes of 70 % ethanol solution (A.1.1.5.22). Centrifuge at 10 000 g to
13 000 g at 4 °C for 15 min, then discard carefully the supernatant. This step is essential for the removal of the
precipitating salts that could interfere with the subsequent analysis (e.g. PCR).
Dry the pellet and re-dissolve it in 100 µl of water or appropriate buffer, e.g. TE buffer (A.1.1.5.19). This is the
DNA master stock. Add RNase-A (A.1.1.5.21) up to a final concentration of 0,1 µg/ml.
A.1.1.8 List of examples
3)
The method has been successfully applied to extract DNA from the following matrices:
3) 3) 3)
acidified soya beans , dehydrated alfalfa, baby biscuits , baby milk , bacteria and spores thereof,
3) 3) 3) 3)
barley seeds, beef/pork paté , beer , blue cheese, brownies , canned corn, carrot seeds, cereal bars ,
3) 3)
cheese, chicken nuggets, chicory leaves, chicory roots, chocolate cookies , chocolate paste , cinnamon
3) 3) 3) 3)
cookies , compotes, cornflakes , cracked rice, dessert cream , dried pea seeds, maize biscuits ,
maize feeding oil cakes, maize flour, maize gluten feed, maize seeds, manioc hard pellets for feed,
3)
manioc tapioca meat, fresh and cooked meats (beef, pork, chicken and turkey), melon fruit pulp, melon
3) 3) 3)
seeds, minced meat, muesli ingredients , muesli , mung bean sprouts , oat seeds, potato tuber,
3) 3)
rapeseed feeding oil cake, glupacolza, rapeseed seeds, sausages (slicing and cocktail (see A.1.2 for
3) 3)
an improved extraction method), schnitzel, sooie hoi sin , soup balls, soya protein in meat preparations ,
3) 3)
soya lecithin (raw brown and yellow refined ), soya sprouts , soya drinks, soya beans, soya bean cream,
3)
soya bean feeding oil cake, soya bean tofu, spaghetti sauce , spelt seeds, sugar beet (dried pulp), sugar
3)
beet (fresh root), sugar beet seeds, sunflower seeds, tofu, tomato fresh fruit, tomato purée , tomato
3) 3)
seeds, vegetarian hamburger, waffles (with and without chocolate), wheat bran, wheat flour, wheat
3)
gluten feed, wheat seeds, wheat semolina, yoghurt (see A.1.3 for an improved extraction method).
A.1.2 Phenol/chloroform method: Protocol for starter cultures of fermented sausages
A.1.2.1 General
This method is designed to isolate the total DNA, including bacterial genomic DNA, from sausages. The
applicability of the method to obtain DNA of high quality suitable for the specific detection of recombinant DNA
[6]
by PCR has been demonstrated for fermented sausages as well as for thermally treated fermented
[7]
sausages, so-called summer sausages . In addition, the extraction method was shown to be suitable to
[8]
isolate total DNA from cream to detect specifically Staphylococcus aureus in this food matrix . (For a
summary of the matrices for which the method is suitable, see A.1.2.8.)
A.1.2.2 Validation status
This method has been validated by an interlaboratory study on a test portion of 0,4 g (see A.1.2.9).
3) Repeatability may depend on the batch of the matrix and/or to its production technology. In some cases, DNA could
not be found or was degraded in such a way that PCR results were below the limit of detection of the method, irrespective
of the PCR primers/protocols used. This may be a source of low reproducibility between laboratories.
10 © ISO 2005 – All rights reserved
A.1.2.3 Principle
The method consists of the recovery of bacterial cells from the food matrix by homogenization of the sausage
samples, followed by a centrifugation step. The sediment contains not only bacterial cells but also meat
particles. For specific lysis of the bacterial cells, the cell walls are degraded by addition of lysozyme. To
improve the degradation of cell walls of meat lactobacilli, mutanolysin can be added. Complete lysis of the
cells is performed by addition of the detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) and proteinase-K, followed by
several extractions of the aqueous phase with phenol and/or chloroform. The phenol/chloroform extraction
step is important to eliminate any nuclease activities and PCR-inhibiting substances including those arising
from the food matrix (e.g. haematin). A final precipitation of DNA by ethanol is performed.
A.1.2.4 Safety precautions
A fume hood is necessary for handling organic chemicals.
A.1.2.5 Reagents
A.1.2.5.1 Isopropanol [CH CH(OH)CH ].
3 3
A.1.2.5.2 Ethanol, ϕ(C H OH) = 96 %.
2 5
Store and use at −20 °C.
A.1.2.5.3 Glacial acetic acid (CH COOH).
A.1.2.5.4 Hydrochloric acid, φ(HCl) = 37 %.
A.1.2.5.5 Sodium hydroxide (NaOH).
A.1.2.5.6 Isoamyl alcohol [(CH ) CHCH CH OH)].
3 2 2 2
A.1.2.5.7 Phenol (C H OH).
6 5
A.1.2.5.8 Chloroform (CHCl ).
A.1.2.5.9 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
A.1.2.5.10 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na EDTA) (C H N O Na ).
2 10 14 2 8 2
A.1.2.5.11 Sodium dodecyl sulfate (SDS) (C H O SNa).
12 25 4
A.1.2.5.12 Lysozyme
50 000 U/mg protein (1 U will produce a ∆A of 0,001 per minute at pH 6,24 and 25 °C, using a suspension
of Micrococcus lysodeikticus as substrate, in a 2,6 ml reaction mixture using a 1 cm light path).
A.1.2.5.13 Sucrose (C H O ).
12 22 11
A.1.2.5.14 Proteinase-K, approximately 20 Units/mg lyophilisate.
A.1.2.5.15 Sodium acetate (C H O Na).
2 3 2
A.1.2.5.16 Equilibrated phenol, saturated with Tris/HCl (pH > 7,8) buffer, or prepared according to
Reference [5], or according to the manufacturer's recommendations.
A.1.2.5.17 Chloroform-isoamyl alcohol
Mix 24 volume parts of chloroform (A.1.2.5.8) with 1 volume part of isoamyl alcohol (A.1.2.5.6).
A.1.2.5.18 Phenol-chloroform-isoamyl alcohol
Prepare by mixing 25 volume parts of equilibrated phenol (A.1.2.5.16) with 24 volume parts of chloroform
(A.1.2.5.8) and 1 volume part of isoamyl alcohol (A.1.2.5.6).
A.1.2.5.19 Mutanolysin-solution, containing 500 U/ml or 5 000 U/ml mutanolysin, dissolved in sterile water.
Do not autoclave. Store at –20 °C, but avoid repeated freezing and thawing.
A.1.2.5.20 Lysozyme solution, containing 10 mg/ml, dissolved in sterile water.
Do not autoclave. Store at –20 °C, but avoid freezing and thawing.
A.1.2.5.21 Sucrose solution, ρ(C H O ) = 400 g/l.
12 22 11
A.1.2.5.22 Buffer solution A, c(Tris) = 0,020 mol/l, c(Na EDTA) = 0,020 mol/l, c(NaCl) = 0,1 mol/l.
Adjust the pH to 8,0 with HCl or NaOH.
A.1.2.5.23 Extraction/lysis buffer, containing one volume part of buffer solution A (A.1.2.5.22) and
one volume part of sucrose solution (A.1.2.5.21).
A.1.2.5.24 SDS solution, ρ(SDS) = 250 g/l.
A.1.2.5.25 Proteinase-K solution, containing 20 mg/ml, stored at −20 °C, dissolved in sterile water.
Do not autoclave. Store at – 20 °C, but avoid repeated freezing and thawing.
A.1.2.5.26 Ethanol solution, φ(C H OH) = 70 %.
2 5
Store and use at −20 °C.
A.1.2.5.27 Sodium acetate solution, c(C H O Na) = 3 mol/l.
2 3 2
Adjust the pH to 5,2 with glacial acetic acid.
A.1.2.5.28 TE buffer, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(Na EDTA) = 0,001 mol/l.
Adjust the pH to 8,0 with HCl or NaOH.
A.1.2.6 Apparatus and equipment
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
A.1.2.6.1 Instrument and/or material for chopping tissue (e.g. scalpel).
A.1.2.6.2 Centrifuge, capable of achieving an acceleration of 12 000 g.
In some steps a refrigerated centrifuge is required.
12 © ISO 2005 – All rights reserved
A.1.2.6.3 Water bath or incubator.
A.1.2.6.4 Vacuum dryer (optional).
2)
A.1.2.6.5 Mixer, e.g. Vortex .
A.1.2.7 Procedure
A.1.2.7.1 General
Once the matrix test portion has been prepared, apply the following DNA extraction/purification protocol.
Scale-adaptation of masses and buffer volumes is required as a function of the selected size of the test
portion.
A.1.2.7.2 Sample preparation
Chop the meat sausage, homogenize it and add 200 mg to 500 mg to 3 volumes of water (up to 1,5 ml). Keep
at room temperature for about 10 min.
A.1.2.7.3 Extraction procedure
Carefully transfer 500 µl of the aqueous phase (suspension) to a new reaction vessel. Centrifuge for 10 min at
12 000 g.
Discard the supernatant and re-suspend the pellet in 500 µl of extraction/lysis buffer (A.1.2.5.23).
Add 50 µl of lysozyme solution (A.1.2.5.20). Incubate at 37 °C for 1 h. If the results are not satisfactory,
lysozyme may be combined with 10 U of mutanolysin (A.1.2.5.19), but the matrix-specific effect of this should
be tested prior to routine application.
Add 25 µl of SDS solution (A.1.2.5.24) and 25 µl of proteinase-K solution (A.1.2.5.25), then incubate for
10 min at 60 °C.
Add 1 volume of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (A.1.2.5.18) and mix.
Centrifuge the mixture for 3 min at about 12 000 g. Transfer the upper aqueous phase to a new vial.
Add 1 volume of chloroform-isoamyl alcohol (A.1.2.5.17) and mix.
Centrifuge for 3 min at about 12 000 g. Transfer the upper phase to a new reaction vessel.
Add 0,1 volume of sodium acetate solution (A.1.2.5.27) and 1 volume of isopropanol (A.1.2.5.1). Mix gently
several times by inversion.
Keep at room temperature for at least 30 min. Centrifuge for 15 min at about 12 000 g. Decant the supernatant
and discard it.
Wash the pellet carefully with at least 500 µl of ethanol solution (A.1.2.5.26), shaking gently. Centrifuge the
mixture for 10 min at about 12 000 g. This step is essential for the removal of the precipitating salts that could
interfere with the subsequent analysis (e.g. PCR).
Discard the supernatant.
Dry the pellet and re-dissolve it in 100 µl of water or appropriate buffer, e.g. TE buffer (A.1.2.5.28). This is the
DNA master stock.
A.1.2.8 List of examples
See Table A.1.
Table A.1 — List of matrices for which the method has been successfully applied
Matrices successfully analysed Microorganism Reference
Fermented sausage Lactobacillus curvatus [6]
Summer sausage (thermally treated) Lactobacillus curvatus [7]
Cream Staphylococcus aureus [8]
A.1.2.9 Validation
The validation data in Table A.2 have been elaborated in a collaborative study carried out by the working
group “Development of methods for identifying foodstuffs produced by genetic engineering techniques” of the
Commission of the former German Federal Health Board for the implementation of methods according to
[6]
article 35 of the German Foodstuffs Act .
In this collaborative study, two samples were false positive, probably caused by incorrect packing.
Mutanolysin was not used for this study.
Table A.2 — Validation data
Number of sausage
Number of laboratories Number of
samples per Number of samples correctly identified
participating total samples
laboratory
15 10 150 148 (control samples and GMO samples)
A.1.3 Phenol/chloroform method: Protocol for starter cultures of yoghurt
A.1.3.1 General
This method describes a procedure for the extraction of bulk DNA from starter cultures used for the
fermentation of the milk product yoghurt. This procedure was successfully carried out with plain yoghurts,
yoghurts co
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21571
Première édition
2005-02-15
Produits alimentaires — Méthodes
d'analyse pour la détection des
organismes génétiquement modifiés et
des produits dérivés — Extraction des
acides nucléiques
Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically
modified organisms and derived products — Nucleic acid extraction
Numéro de référence
©
ISO 2005
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Principe. 1
3.1 Généralités. 1
3.2 Extraction de l'ADN. 2
3.3 Quantification de l'ADN . 2
4 Exigences générales applicables aux laboratoires. 2
5 Mode opératoire. 2
5.1 Préparation de la prise d'essai . 2
5.2 Extraction/purification de l'ADN . 4
5.3 Quantification de l'ADN extrait . 5
5.4 Stabilité de l'ADN extrait . 6
6 Interprétation. 6
7 Rapport d'essai. 6
Annexe A (informative) Méthodes pour l'extraction de l'ADN. 8
Annexe B (informative) Méthodes de quantification de l'ADN extrait. 36
Bibliographie . 43
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'ISO 21571 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
Introduction
La recherche d'ingrédients génétiquement modifiés comprend les étapes successives (ou simultanées)
suivantes. Après la collecte de l'échantillon, les acides nucléiques sont extraits de la prise d'essai. Les acides
nucléiques extraits peuvent faire l'objet d'une purification plus poussée lors du processus d'extraction ou
ultérieurement. Ensuite, ils sont quantifiés (si besoin est), dilués (si besoin est) et soumis à des modes
opératoires analytiques (comme la PCR). Ces étapes sont décrites en détail dans le présent document et
dans les Normes internationales suivantes:
ISO 21568, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Échantillonnage
ISO 21569, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
ISO 21570, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des acides nucléiques
D'autres informations concernant les définitions et aspects généraux évoqués dans les étapes citées ci-avant
sont réunies dans le document suivant:
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés fondées sur l'utilisation des acides nucléiques — Exigences générales et
définitions
L'Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l'attention sur le fait que la mise en conformité avec
la présente Norme peut nécessiter l'utilisation d'un droit de propriété intellectuelle concernant la méthode
d'extraction fondée sur l'utilisation de la silice (N° EP 0389063/USP 5,234,809), donnée dans l'Article 4.
L'ISO ne saurait être tenue responsable concernant la preuve, la validité et le champ d'application dudit droit
de propriété.
Le propriétaire des droits de propriété industrielle a exprimé auprès de l'ISO sa volonté de négocier des
licences selon des termes et des conditions raisonnables et non discriminants avec les requérants dans le
monde. En ce qui concerne ces questions, la déclaration du propriétaire desdits droits de propriété industrielle
est enregistrée auprès de l'ISO. Pour de plus amples informations, contacter:
Jean Deleforge
BioMérieux
Chemin de l'Orme
69280 Marcy l'Étoile, France
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle autres que les droits identifiés ci-avant. L'ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
NORME INTERNATIONALE ISO 21571:2005(F)
Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection
des organismes génétiquement modifiés et des produits
dérivés — Extraction des acides nucléiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale indique les exigences générales et les méthodes spécifiques pour
l'extraction, la purification et la quantification de l'ADN. Ces méthodes sont décrites dans les Annexes A et B.
La présente Norme internationale a été élaborée pour les matrices alimentaires, mais peut également
s'appliquer à d'autres matrices (par exemple grains et aliments pour animaux).
Elle a été conçue dans le cadre d'une série de méthodes d'analyse fondées sur l'utilisation de l'acide
nucléique, notamment l'ISO 21569 (méthodes d'analyse qualitative) et l'ISO 21570 (méthodes d'analyse
quantitative).
2 Références normatives
Les documents référencés ci-après sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition de la
publication (y compris ses amendements) à laquelle il est fait référence s'applique.
1)
ISO 24276:— , Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés fondées sur l'utilisation des acides nucléiques — Exigences générales et
définitions
ISO 21568, Produits alimentaires — Méthodes d'analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Échantillonnage
3 Principe
3.1 Généralités
L'objectif des méthodes d'extraction des acides nucléiques est de disposer d'acides nucléiques appropriés
pour les analyses ultérieures (voir l'ISO 24276).
NOTE 1 La «qualité» de l'ADN est liée à la longueur moyenne des molécules d'ADN extraites, de la pureté chimique et
de l'intégrité structurale de la séquence d'ADN et de la double hélice, par exemple de la présence de liaisons intra et
interbrin entre les bases, de brèches dans les fragments simple brin, des liaisons croisées avec des polyols, de l'hémine,
etc. En outre, de telles altérations sont souvent spécifiques à la séquence et ne sont donc pas distribuées de façon
aléatoire le long du génome (voir Références [1], [2], [3], [4]).
L'attention des utilisateurs de la présente Norme internationale est attirée sur le fait que certaines méthodes,
telles que les méthodes utilisant la silice, sont susceptibles d'être protégées par des droits de propriété
intellectuelle.
1) À publier.
3.2 Extraction de l'ADN
Le principe de base de l'extraction de l'ADN consiste à libérer l'ADN présent dans la matrice et, parallèlement
ou par la suite, à éliminer les inhibiteurs de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de l'ADN.
Des méthodes d'extraction et de purification de l'ADN sont décrites à l'Annexe A. C'est pourquoi l'utilisateur
choisit la méthode la plus appropriée en fonction de la matrice à étudier d'après son expérience, en prenant
en compte le domaine d'application et les exemples de matrices donnés dans chaque méthode.
D'autres protocoles sont applicables à condition que la méthode ait été validée pour la matrice spécifiquement
soumise à essai.
3.3 Quantification de l'ADN
La quantification de l'ADN extrait pourrait être utilisée par la suite pour les analyses par PCR.
Elle peut être effectuée à l'aide de méthodes physiques (par exemple mesure d'absorbance à une longueur
d'onde spécifique), physico-chimiques (par exemple utilisation d'agents intercalants ou liants permettant une
émission de fluorescence), enzymatique (par exemple détection par bioluminescence) ou par PCR
quantitative. La dernière méthode est particulièrement bien adaptée aux matrices composites ou aux
échantillons à faible teneur en ADN ou dont l'ADN est dégradé.
Il existe plusieurs méthodes permettant de quantifier l'ADN présent dans une solution, qui sont décrites à
l'Annexe B. Le choix de la méthode la plus appropriée incombe à l'utilisateur, qui doit tenir compte de la
quantité et de la qualité d'ADN à analyser et, par conséquent, de la matrice de laquelle l'ADN a été extrait.
D'autres protocoles sont applicables à condition que la méthode ait été validée pour la matrice spécifiquement
soumise à essai.
4 Exigences générales applicables aux laboratoires
Une contamination accidentelle par de l'ADN peut provenir de poussières ou d'aérosols. En conséquence,
l'organisation de l'espace de travail au sein des laboratoires est logiquement fondée sur
le confinement systématique des étapes méthodologiques intervenant dans l'obtention des résultats, et
le principe de la marche en avant concernant la manipulation des échantillons.
Le second principe garantit que l'ADN à analyser et l'ADN amplifié produit par PCR sont soumis à une
ségrégation physique.
Des informations plus détaillées figurent dans l'ISO 24276.
5 Mode opératoire
5.1 Préparation de la prise d'essai
5.1.1 Généralités
Les variables spécifiques au produit (par exemple l'humidité) et le traitement peuvent avoir une incidence sur
la quantité et la qualité de l'ADN extrait du matériau étudié. Par conséquent, les caractéristiques de
performance d'une méthode d'extraction donnée dépendent de la matrice étudiée.
Prendre les mesures appropriées afin que la prise d'essai soit représentative de l'échantillon de laboratoire.
2 © ISO 2005 – Tous droits réservés
La prise d'essai doit être de taille suffisante et contenir un nombre suffisant de particules pour être
représentative de l'échantillon de laboratoire, par exemple 3000 particules pour une limite de détection de
0,1 %, afin de permettre une analyse statistiquement valable (voir l'ISO 21568).
Pour des raisons pratiques/techniques, il est recommandé de ne pas utiliser de prise d'essai de masse
supérieure à 2 g.
Toute restriction liée à la représentativité suivant la taille de la prise d'essai doit être consignée et prise en
compte dans l'interprétation des résultats d'analyse. Les méthodes d'extraction de l'ADN présentées dans
l'Annexe A décrivent des prises d'essai comprises entre 200 mg et 500 mg, qui conviennent généralement
pour des matériaux riches en ADN (par exemple des grains moulus, de la farine). Néanmoins, dans certaines
matrices contenant des quantités d'ADN faibles ou de l'ADN dégradé, la quantité d'ADN extraite peut ne pas
être suffisante pour des analyses. Dans ce cas, la prise d'essai peut être augmentée.
Les extractions d'ADN doivent être effectuées sur au moins deux prises d'essai.
Le stockage des étalons, des échantillons et des prises d'essai doit satisfaire aux exigences de l'SO 24276 et
être organisé de manière à préserver les paramètres biochimiques à analyser (voir l'ISO/CEI 17025 pour les
détails).
5.1.2 Échantillons
Toutes les opérations de préparation des échantillons (par exemple broyage, homogénéisation, division,
séchage) doivent être effectuées conformément aux procédures décrites dans l'ISO 24276 en prenant soin
d'éviter toute contamination de l'échantillon ou toute modification de sa composition.
Les échantillons de laboratoire doivent être suffisamment homogènes avant de les réduire et de prélever la
prise d'essai.
Pour les échantillons liquides, secouer le récipient contenant l'échantillon pour améliorer l'homogénéisation du
produit. Dans le cas de produits non homogènes, tels que les huiles brutes, vérifier que les sédiments ont été
complètement éliminés des parois du récipient.
Pour les matrices solides qui ne peuvent pas être mises en suspension facilement, la matrice doit être broyée
afin de réduire la taille des particules et/ou faciliter l'extraction de l'ADN. Dans ce cas, une attention
particulière doit être accordée à la taille des particules. La prise d'essai soumise à l'extraction doit contenir un
nombre minimal de particules, conformément à l'ISO 21568. Il convient que les dispositifs de
mouture/broyage puissent être complètement nettoyés; ces dispositifs doivent être sélectionnés de façon à
atteindre le nombre de particules et la distribution de tailles de particules souhaités dans la prise d'essai,
conformément à l'ISO 21568.
Si des composants de l'échantillon de laboratoire ont été éliminés avant l'extraction, consigner cette
procédure.
Concernant les produits finis sous forme solide ou pâteuse ayant une teneur en lipides élevée, il n'est
généralement pas facile d'obtenir la taille de particules souhaitée en effectuant une seule étape de broyage.
Plusieurs modes opératoires peuvent donc être ajoutés, comme l'extraction des lipides à l'aide d'hexane
après broyage et congélation ou après lyophilisation avant broyage.
Pour faciliter le broyage des produits pâteux ou visqueux, il est possible d'appliquer à certaines matrices l'un
des traitements suivants:
chauffage jusqu'à la température maximale de 40 °C;
dissolution dans un liquide approprié, par exemple l'eau;
congélation à une température inférieure ou égale à –20 °C.
Homogénéiser l'ensemble de l'échantillon de laboratoire. Prélever les deux prises d'essai en tenant compte
des dilutions ou concentrations éventuelles.
Il convient de prendre des précautions afin que le mode opératoire de mouture/broyage réduise le plus
possible le chauffage de l'échantillon, car le chauffage peut avoir un effet négatif sur la qualité de l'ADN extrait.
Les techniques de mouture/broyage présentant un important risque de contamination croisée (comme celles
utilisant conjointement de l'azote liquide et un mortier) doivent être évitées autant que possible. Suivant les
bonnes pratiques, il convient d'isoler des autres étapes analytiques toute étape produisant de la poussière.
Si des sels, des épices et des sucres en poudre et/ou d'autres substances susceptibles d'avoir une incidence
sur l'extraction ou l'analyse sont présents, il convient de considérer des étapes de purification appropriées
conformément à la méthode sélectionnée (voir Annexe A).
Par exemple, dans les échantillons provenant de matrices composites, la matrice cible (par exemple la
couche de panure des bâtonnets de poisson) peut être isolée pour permettre l'extraction de l'ADN.
5.2 Extraction/purification de l'ADN
5.2.1 Généralités
Les considérations ci-après s'appliquent pour la conception des méthodes d'extraction.
Il convient que la qualité de l'acide extrait et le rendement d'extraction suivant une méthode donnée sur une
matrice donnée soient à la fois répétables et reproductibles en termes d'analyse, lorsque la quantité d'acide
nucléique présent dans la matrice dont il a été extrait est suffisante.
Pour obtenir de l'ADN de bonne qualité, il est conseillé d'éliminer, lorsque cela est approprié:
les polysaccharides (pectine, cellulose, hémi-cellulose, amidon, agents épaississants, etc.) au moyen de
traitements enzymatiques appropriés (par exemple pectinase, cellulase, hemi-cellulase, α-amylase) ou
par extraction organique (par exemple bromure d'hexadecyltriméthylammonium/chloroforme);
l'ARN et/ou les protéines par un traitement approprié, par exemple un traitement enzymatique par RNase
dans le premier cas et un traitement par protéinase dans le second cas;
les fractions lipidiques, par traitement enzymatique ou à l'aide de solvants (comme le n-hexane);
les sels (par exemple à partir du tampon d'extraction/de lyse, à partir de l'étape de précipitation)
susceptibles de perturber les analyses ultérieures.
Dans le cas d'échantillons solides ou secs, en particulier, il convient que le volume de tampon d'extraction/de
lyse soit adapté pour garantir la mise en solution de l'ADN.
NOTE 1 La purification de l'ADN peut être effectuée par différentes méthodes comme la précipitation fractionnée,
l'utilisation de solvants tels que le phénol, le chloroforme, l'éthanol, l'isopropanol et/ou par adsorption sur des matrices
solides (résine échangeuse d'ions, gel de silice ou de verre, terre de diatomées, membranes, etc.). Plusieurs méthodes de
purification de l'ADN peuvent être combinées. Le cas échéant, l'extraction et la purification peuvent être effectuées en une
seule étape.
Si un produit co-précipitant de l'ADN, tel que le glycogène, le PEG ou l'ARNt est utilisé pour augmenter la
récupération d'ADN lors des étapes de précipitation, il ne doit présenter ni activité nucléasique, ni
inhibiteurs/compétiteurs de la PCR, ni homologie de séquence avec la cible potentielle de la PCR à l'étude.
Pour les plantes génétiquement modifiées, le porteur d'ADN peut être, par exemple, de l'ADN de sperme de
saumon ou de hareng.
Lorsque des appareils de lyophilisation sous vide sont utilisés pour sécher les pelotes d'ADN après
précipitation, il convient de prendre en compte le risque de contamination croisée.
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Remettre l'ADN en solution dans l'eau ou dans une solution tampon qui évite la dégradation de l'ADN.
Lorsqu'une nouvelle méthode d'extraction de l'ADN est mise en œuvre ou lorsque l'une des méthodes
décrites à l'Annexe A est appliquée à une nouvelle matrice, il convient que la qualité et l'intégrité potentielles
de l'ADN extrait à l'aide du protocole choisi soient évaluées de la manière suivante: une quantité connue de
traceur ADN est ajoutée au tampon de lyse en plus de l'échantillon utilisé pour l'extraction de l'ADN. Lorsque
le traceur choisi est une quantité prédéterminée d'ADN ou représente un nombre prédéterminé de copies
d'une séquence ADN donnée, mélangés à une matrice au début de l'extraction de l'ADN , une attention
particulière doit être accordée pour établir l'absence d'homologie entre la séquence du traceur et la séquence
de l'ADN à l'étude.
NOTE 2 L'utilisation d'un traceur ADN permet une bonne approximation de la situation réelle lorsque l'ADN d'une
matrice donnée est supposé être associé à d'autres composants (par exemple des protéines). Une telle méthode pourrait
également être utilisée pour estimer la présence d'inhibiteurs de PCR solubles et en position trans dans l'ADN extrait (voir
l'ISO 24276, l'ISO 21569 et l'ISO 21570).
Le traceur ADN peut donner une fausse impression de récupération; toutefois, le traceur ADN peut être plus
facile à séparer de la matrice que l'ADN cible.
5.2.2 Contrôles
Les contrôles à inclure sont décrits dans le Tableau 1 de l'ISO 24276:—. Il convient que ces contrôles incluent
au moins un contrôle d'extraction à blanc, un contrôle d'extraction positif mais également un contrôle de
l'environnement.
5.2.3 Contrôle de pureté de l'ADN: contrôle interne par PCR
Lorsqu'une nouvelle méthode d'extraction de l'ADN est mise en œuvre, la présence d'inhibiteurs de PCR dans
l'ADN extrait peut être estimée à l'aide d'ajouts d'ADN (voir l'ISO 24276, l'ISO 21569 et l'ISO 21570). La
quantité d'ADN ajouté ne doit pas dépasser le niveau maximal supporté par la PCR et contenir un nombre
déterminé de copies de séquences cibles. Il convient que ce nombre soit déterminé individuellement pour
chaque séquence cible et indiqué sous la forme d'un multiple de la limite de détection inférieure existante.
Idéalement, il convient que la concentration cible du contrôle PCR positif corresponde à la sensibilité
nécessaire pour l'analyse. Des précautions particulières doivent être prises lors de l'utilisation d'ADN cible
cloné très concentré. Dans la mesure du possible, les contrôles positifs doivent être conformes aux conditions
des produits soumis à essai en ce qui concerne les acides nucléiques qu'ils contiennent.
5.3 Quantification de l'ADN extrait
5.3.1 Généralités
La qualité, l'intégrité et le volume de la matrice ont une incidence sur la performance de la méthode analytique
et donc les résultats obtenus. Par conséquent, la limite de détection d'une méthode spécifique peut dépendre
de la quantité d'acides nucléiques utilisée.
La quantification de l'ADN permet de:
comparer le rendement de différents protocoles d'extraction de l'ADN pour une matrice donnée
(répétabilité), et de
mesurer la concentration en acides nucléiques avant l'analyse.
5.3.2 Domaine de mesure
Chaque méthode de quantification doit être appliquée dans la gamme dynamique applicable en tenant
également compte de son niveau de fidélité.
5.3.3 Étalons de quantité
L'exactitude des méthodes de quantification dépend des étalons d'acide nucléique utilisés pour étalonner la
méthode.
Si la méthode utilisée est sensible à la taille et/ou à la qualité des fragments d'acide nucléique, alors il faut
utiliser les étalons d'acide nucléique correspondant à la taille et/ou à la qualité de l'acide nucléique attendu.
Il convient que le matériau de référence utilisé garantisse la traçabilité aux références spécifiées,
généralement des étalons nationaux ou internationaux, par le biais d'une chaîne de comparaison
ininterrompue (voir le Guide ISO 30).
Si la méthode utilisée fait intervenir des agents intercalants, il convient d'utiliser un étalon d'ADN de masse
moléculaire élevée pour quantifier un ADN de masse moléculaire élevée. Il convient d'utiliser un étalon d'ADN
de masse moléculaire faible pour quantifier de l'ADN de masse moléculaire faible. À noter que l'ADN extrait,
même s'il est décrit comme ayant une masse moléculaire élevée, contient généralement une certaine quantité
de fragments de masse moléculaire faible. Cela signifie que de nombreuses méthodes employées pour la
quantification d'ADN manquent souvent d'exactitude, ce facteur devant être pris en compte.
NOTE En outre, suivant la matrice et le type de méthode d'extraction, une certaine proportion de l'ADN extrait peut
être récupérée sous forme d'ADN simple brin (avec une capacité d'intercalation bien plus faible), ce qui entraîne une
sous-estimation de la teneur globale en ADN. En revanche, l'ADN simple brin est bien détecté par mesurage physique.
Au moins trois points d'étalonnage (de préférence provenant de réplicats) sont requis pour établir une bonne
courbe d'étalonnage. La quantité d'étalon d'ADN utilisée pour chaque point d'étalonnage dépend de la
sensibilité de la méthode et de la gamme dynamique considérée.
5.4 Stabilité de l'ADN extrait
L'ADN extrait en vue d'analyses ultérieures doit être stocké dans des conditions garantissant sa stabilité.
Il convient d'éviter de congeler et de décongeler plusieurs fois des solutions d'ADN.
6 Interprétation
La méthode d'extraction de l'ADN doit être adaptée de façon à obtenir la qualité et la quantité d'acide
nucléique souhaitée en vue de l'analyse ultérieure.
Il convient d'évaluer la qualité de l'acide nucléique extrait à l'aide d'une méthode d'analyse dont les mêmes
paramètres de qualité sont identiques à ceux de l'analyse à réaliser sur l'acide nucléique extrait (par exemple,
si l'analyse à effectuer est une PCR, il convient alors qu'une PCR supplémentaire soit utilisée pour l'évaluation
de la qualité de l'ADN extrait).
D'autres paramètres de compatibilité figurent dans l'ISO 21569, l'ISO 21570 et l'ISO 24276.
7 Rapport d'essai
Le rapport d'essai final doit être conforme à l'ISO 24276 et contenir les informations complémentaires
suivantes afin de documenter l'activité du laboratoire:
une description de la procédure de dérivation des prises d'essai, ainsi que de tout traitement préliminaire
auquel l'échantillon a été soumis avant extraction de l'acide nucléique;
la taille des prises d'essai utilisées pour l'extraction de l'acide nucléique;
le(s) protocole(s) d'extraction de l'acide nucléique appliqué(s);
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toute particularité observée durant les essais;
toute opération non spécifiée dans la méthode ou considérée comme facultative mais pouvant avoir une
incidence sur les résultats;
l'interprétation des résultats;
le nom de la ou des personne(s) chargée(s) des expériences.
NOTE Le stockage et la manipulation des données brutes sont décrits dans l'ISO/CEI 17025, ainsi que les
programmes d'assurance qualité associés. La conformité aux spécifications est recommandée.
Annexe A
(informative)
Méthodes pour l'extraction de l'ADN
A.1 Préparation d'ADN de qualité PCR à l'aide des méthodes d'extraction utilisant
le phénol/chloroforme
A.1.1 Méthode de base d'utilisation du phénol/chloroforme
A.1.1.1 Domaine d'application
Cette méthode de routine (voir Référence [5]) convient pour l'extraction de l'ADN à partir d'une grande variété
de matrices (voir A.1.1.8).
Le phénol convient généralement très bien à la destruction des nucléases et à la dénaturation des protéines.
Lorsque des feuilles ou du matériel frais (par exemple des feuilles de chicorée, de la luzerne sèche, etc.) sont
à analyser, de nombreux inhibiteurs de PCR peuvent également co-précipiter avec l'ADN. Pour cette raison, il
peut être difficile d'obtenir de l'ADN amplifiable par PCR de façon reproductible.
Les propriétés corrosives du phénol doivent être prises en considération. C'est pourquoi les méthodes
d'extraction utilisant le bromure d'hexadecyltriméthylammonium et/ou le PVP et/ou l'adsorption sur silice sont
de préférence exploitées en priorité.
A.1.1.2 État
La méthode est connue depuis quarante ans et a été largement appliquée dans tous les domaines de la
biologie, de l'agronomie et de la médecine, mais n'a jamais été évaluée par le biais d'essais interlaboratoires
concernant la détection des OGM dans les aliments.
A.1.1.3 Principe
La méthode consiste en une étape de lyse (lyse thermique en présence de dodécyl sulfate de sodium et
d'EDTA concentré), suivie de l'élimination des contaminants (comme les molécules lipophiles, les
polysaccharides et les protéines) et de nucléases à partir de la phase aqueuse contenant l'ADN à l'aide de
phénol et de chloroforme. Une précipitation finale de l'ADN à l'éthanol concentre l'ADN et élimine les sels et le
[5]
chloroforme résiduel. L'étape critique de la méthode est l'étape de lyse .
A.1.1.4 Mesures générales et de sécurité
Une hotte aspirante est nécessaire pour la manipulation des produits chimiques organiques.
A.1.1.5 Réactifs
A.1.1.5.1 Éthanol, fraction volumique φ (C H OH) = 96 %.
2 5
Stocker et utiliser à –20 °C.
A.1.1.5.2 Acide acétique glacial (CH COOH).
A.1.1.5.3 Acétate de potassium (C H O K).
2 3 2
8 © ISO 2005 – Tous droits réservés
A.1.1.5.4 Acide chlorhydrique, φ (HCl) = 37 %.
A.1.1.5.5 Alcool isoamylique [(CH ) CHCH CH OH].
3 2 2 2
A.1.1.5.6 Phénol (C H OH).
6 5
A.1.1.5.7 Chloroforme (CHCl ).
A.1.1.5.8 Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
A.1.1.5.9 Sel de dipotassium de l'acide éthylènediaminetétraacétique (K EDTA) (C H N O K ).
2 10 14 2 8 2
A.1.1.5.10 Hydroxyde de potassium (KOH).
A.1.1.5.11 Chlorure de potassium (KCl).
A.1.1.5.12 Dodécyl sulfate de sodium (SDS) (C H O SNa).
12 25 4
A.1.1.5.13 Protéinase K, environ 20 Unités/mg de lyophilisat.
A.1.1.5.14 RNase-A, exempte de DNase, extraite de pancréas de bovin contenant environ 50 Unités de type
Kunitz par mg de lyophilisat.
A.1.1.5.15 Phénol équilibré, pH > 7,8.
Utiliser du phénol équilibré par rapport au tampon d'extraction (A.1.1.5.18) sans dodécyl sulfate de sodium
(SDS) ou préparé conformément à la Référence [5] ou aux recommandations du fabricant.
A.1.1.5.16 Chloroforme-alcool isoamylique
Mélanger 24 volumes de chloroforme (A.1.1.5.7) avec 1 volume d'alcool isoamylique (A.1.1.5.5).
A.1.1.5.17 Phénol-chloroforme-alcool isoamylique
Mélanger 1 volume de phénol équilibré (A.1.1.5.15) avec 1 volume de chloroforme-alcool isoamylique
(A.1.1.5.16).
A.1.1.5.18 Tampon d'extraction/de lyse, concentration molaire c(TRIS) = 0,050 mol/l,
c(K EDTA) = 0,050 mol/l, concentration massique ρ (SDS) = 30 g/l.
Ajuster le pH à 8,0 à l'aide de HCl ou de KOH.
A.1.1.5.19 Tampon TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(K EDTA) = 0,001 mol/l.
Ajuster le pH à 8,0 à l'aide de HCl ou de KOH.
A.1.1.5.20 Solution de protéinase K, ρ = 20 mg/ml, dissoute dans de l'eau stérile.
Ne pas autoclaver. Stocker à –20 °C en évitant de congeler et de décongeler plusieurs fois.
A.1.1.5.21 Solution de RNase-A, lyophilisat ρ (RNase-A) = 10 mg/ml.
Stocker à –20 °C en évitant de congeler et de décongeler plusieurs fois.
A.1.1.5.22 Solution d'éthanol, φ (C H OH) = 70 %.
2 5
Stocker et utiliser à –20 °C.
A.1.1.5.23 Solution d'acétate de potassium, c(C H O K) = 3 mol/l.
2 3 2
Ajuster le pH à 5,2 à l'aide d'acide acétique glacial. Ne pas autoclaver. Si besoin est, filtrer à l'aide d'un filtre
de 22 µm.
A.1.1.6 Appareillage et équipements
Matériel courant de laboratoire et, notamment, l'appareillage suivant.
A.1.1.6.1 Centrifugeuse, pouvant fonctionner à au moins 10 000 g.
Dans certains cas, une centrifugeuse réfrigérée est requise.
A.1.1.6.2 Bain d'eau ou incubateur, réglable en température de 60 °C à 70 °C.
A.1.1.6.3 Dessiccateur sous vide (facultatif).
A.1.1.6.4 Lyophilisateur (facultatif).
2)
A.1.1.6.5 Agitateur, par exemple Vortex .
A.1.1.6.6 Récipients à réaction, résistant à la congélation dans de l'azote liquide.
A.1.1.7 Mode opératoire
A.1.1.7.1 Généralités
Une fois la prise d'essai préparée à partir d'une matrice, appliquer le protocole d'extraction/de purification de
l'ADN suivant. Les masses et les volumes de tampons doivent être adaptés en fonction de la taille de la prise
d'essai.
A.1.1.7.2 Mode opératoire d'extraction
Peser 0,25 g de l'échantillon d'essai dans un microtube.
Ajouter 1,6 ml de tampon d'extraction (A.1.1.5.18) et, si besoin est (par exemple pour les matrices riches en
protéines), 50 µl de solution de protéinase K (A.1.1.5.20). Incuber entre 60 °C et 70 °C, pour une durée
généralement comprise entre 30 min et 2 h (il est également possible d'incuber pendant une nuit). Ajouter de
la RNase-A (A.1.1.5.21) jusqu'à atteindre la concentration finale de 0,1 µg/ml. Centrifuger à 5 000 g pendant
30 min et récupérer le surnageant dans un tube propre. Ajouter 1 volume de phénol équilibré (A.1.1.5.15) au
surnageant, puis homogénéiser délicatement. Centrifuger à 5 000 g pendant 15 min et récupérer le
surnageant dans un tube propre. Ajouter 1 volume de phénol-chloroforme-alcool isoamylique (A.1.1.5.17) à la
phase aqueuse, puis homogénéiser délicatement. Centrifuger à 5 000 g pendant 15 min et récupérer la phase
aqueuse dans un tube propre. Répéter cette étape une ou plusieurs fois (selon la matrice) ou jusqu'à ce que
l'interface entre les phases soit nette.
2) Vortex est un exemple d'un produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale mais ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils permettent d’obtenir
les mêmes résultats.
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Ajouter 1 volume de chloroforme/alcool isoamylique (A.1.1.5.16) au surnageant, puis homogénéiser
délicatement. Centrifuger à 5 000 g pendant 10 min et récupérer la phase aqueuse (phase supérieure) dans
un tube propre. Si nécessaire, répéter l'étape jusqu'à ce que l'interface entre les phases soit nette. Mélanger
le surnageant avec 0,1 volume de solution d'acétate de potassium (A.1.1.5.23.) et 2,5 volumes d'éthanol à
96 % (A.1.1.5.1), puis bien mélanger en retournant le tube. Incuber pendant au moins 5 min dans de l'azote
liquide, pendant 1 h à –80 °C ou pendant une nuit à –20 °C. Centrifuger à 10 000 g (ou jusqu'à 13 000 g) à
4 °C ou pendant au moins 15 min, puis éliminer le surnageant avec précaution.
Nettoyer soigneusement la pelote d'ADN à l'aide de 2 volumes de solution d'éthanol à 70 % (A.1.1.5.22).
Centrifuger à une vitesse comprise entre 10 000 g et 13 000 g à 4 °C pendant 15 min, puis éliminer le
surnageant avec précaution. Cette étape est essentielle pour l'élimination des sels qui précipitent et qui
peuvent avoir une influence sur les analyses ultérieures (par exemple PCR).
Sécher la pelote et la redissoudre dans 100 µl d'eau ou dans un tampon approprié, par exemple un tampon
TE (A.1.1.5.19). Ceci constitue la solution mère d'ADN principale. Ajouter la RNase-A (A.1.1.5.21) jusqu'à
obtention de la concentration finale de 0,1 µg/ml.
A.1.1.8 Liste d'exemples
3)
La méthode a été appliquée avec succès pour extraire de l'ADN des matrices suivantes:
3) 3) 3)
fèves de soja acidifié , luzerne déshydratée, biscuit pour bébé , lait maternisé , bactéries et leurs spores,
3) 3) 3)
grains d'orge, pâté de bœuf/porc , bière , fromage bleu, brownie , maïs en boîte, graines de carottes, barre
3) 3)
aux céréales , fromage, croquette de poulet, feuilles de chicorée, racines de chicorée, biscuit au chocolat ,
3) 3) 3) 3)
pâte à tartiner au chocolat , biscuits à la cannelle , compote, pétales de maïs , riz brisé, crème dessert ,
3)
pois secs, biscuit au maïs , tourteau de maïs pour l'alimentation animale, farine de maïs, aliments pour
animaux à base de gluten de maïs, graines de maïs, farine de manioc grossière pour alimentation animale,
3)
chair de tapioca de manioc, viande fraîche et cuite (bœuf, porc, poulet et dinde), pulpe de melon, graines de
3) 3) 3)
melon, viande hachée, ingrédients du muesli , muesli , pousse de haricot mungo , graines d'avoine,
tubercule de pomme de terre, tourteau de colza pour l'alimentation animale, glupacolza, graines de colza,
3) 3)
saucisse [en tranches et saucisses cocktail , voir A.1.2 pour une méthode d'extraction améliorée], schnitzel,
3) 3)
sooie hoi sin , boulettes pour soupe, protéines de soja dans les préparations à base de viandes , lécithine
3) 3)
de soja (brute et raffinée) , pousse de soja , boisson à base de soja, fèves de soja, crème de soja, tourteau
3)
de soja pour l'alimentation animale, tofu de soja, sauce pour spaghetti , graines d'épeautre, pulpe de
betterave séchée, racine de betterave fraîche, graines de betterave, graines de tournesol, tofu, tomate fraîche,
3) 3) 3)
purée de tomate , graines de tomate, hamburger végétarien, gaufre [avec et sans chocolat], son de blé,
3)
farine de blé, aliment pour animaux à base de gluten de blé, grains de blé, semoule de blé, yaourt
(voir A.1.3 pour une méthode d'extraction améliorée).
A.1.2 Méthode au phénol/chloroforme: Protocole pour cultures starter de saucisses
fermentées
A.1.2.1 Domaine d'application
Cette méthode est destinée à isoler l'ADN total (y compris l'ADN génomique des bactéries) des saucisses.
L'applicabilité de la méthode utilisée pour obtenir de l'ADN de qualité satisfaisante pour la détection spécifique
[6]
de l'ADN recombiné par PCR a été démontrée pour des saucisses fermentées ainsi que pour les saucisses
[7]
fermentées ayant subi un traitement thermique, appelées «saucisses d'été» . En outre, il a été démontré
que la méthode d'extraction convient pour isoler l'ADN total de la crème afin de détecter spécifiquement les
[8]
Staphylococcus aureus présent dans cette matrice alimentaire . (Pour un récapitulatif des matrices pour
lesquelles la méthode est valable, voir en A.1.2.8).
3) La répétabilité peut dépendre du lot dont la matrice provient et/ou de la technologie utilisée pour la produire. Dans
certains cas, l’ADN n’a pu être trouvé ou était tellement dégradé que les résultats de la PCR étaient en dessous de la
limite de détection de la méthode, quels que soient les amorces/protocoles PCR utilisés. Cela peut être une source de
faible reproductibilité entre laboratoires.
A.1.2.2 État
Cette méthode a été validée dans le cadre d'une étude interlaboratoires portant sur une prise d'essai de 0,4 g
(voir en A.1.2.9).
A.1.2.3 Principe
La méthode consiste à récupérer des cellules bactériennes dans une matrice alimentaire par
homogénéisation des échantillons de saucisse puis centrifugation. Les sédiments contiennent des cellules
bactériennes, mais également des particules de viande. Pour la lyse spécifique des cellules bactériennes, les
parois cellulaires sont dégradées par ajout de lysozyme. Pour une meilleure dégradation des parois cellulaires
des lactobacilles de la viande, il est possible d'ajouter de la mutanolysine. La lyse complète des cellules est
obtenue en ajoutant le détergent SDS (dodécyl sulfate de sodium) et de la protéinase K, puis en réalisant des
extractions successives de la phase aqueuse à l'aide de phénol et/ou de chloroforme. L'étape d'extraction à
l'aide de phénol/chloroforme est importante pour éliminer toute activité de nucléase et toutes substances
inhibitrices de PCR, notamment celles provenant de la matrice alimentaire (par exemple l'hématine). L'ADN
est finalement précipité à l'éthanol.
A.1.2.4 Mesures générales et de sécurité
Une hotte aspirante est nécessaire pour la manipulation des produits chimiques organiques.
A.1.2.5 Réactifs
A.1.2.5.1 Isopropanol [CH CH(OH)CH ].
3 3
A.1.2.5.2 Éthanol, φ (C H OH) = 96 %.
2 5
Stocker et utiliser à –20 °C.
A.1.2.5.3 Acide acétique glacial (CH COOH).
A.1.2.5.4 Acide chlorhydrique, φ (HCl) = 37 %.
A.1.2.5.5 Hydroxyde de sodium (NaOH).
A.1.2.5.6 Alcool isoamylique [(CH ) CHCH CH (OH)].
3 2 2 2
A.1.2.5.7 Phénol (C H OH).
6 5
A.1.2.5.8 Chloroforme (CHCl ).
A.1.2.5.9 Tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (Tris) (C H NO ).
4 11 3
A.1.2.5.10 Sel de disodium de l'acide éthylènediaminetétraacétique (Na EDTA) (C H N O Na ).
2 10 14 2 8 2
A.1.2.5.11 Dodécyl sulfate de sodium (SDS) (C H O SNa).
12 25 4
A.1.2.5.12 Lysozyme
50 000 Unités/mg de protéine (1 U produit un ∆A de 0,001 par min à pH 6,24 à 25 °C, à l'aide d'une
suspension de Micrococcus lysodeikticus utilisée comme substrat, dans 2,6 ml de mélange réactionnel avec
un chemin optique de 1 cm).
A.1.2.5.13 Sucrose (C H O ).
12 22 11
A.1.2.5.14 Protéinase K, environ 20 Unités/mg de lyophilisat.
12 © ISO 2005 – Tous droits réservés
A.1.2.5.15 Acétate de sodium (C H O Na).
2 3 2
A.1.2.5.16 Phénol équilibré, saturé en tampon Tris/HCl (pH > 7,8) ou préparé conformément à la
Référence [5] ou aux recommand
...
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